[发明专利]使用由互补于靶mRNA的核苷酸序列组成的siRNA抑制靶mRNA表达的方法

说明书

技术领域

本发明一般涉及使用小分子干扰RNA(以下称为“siRNA”)抑制靶mRNA表达的方法，更具体而言，本发明涉及一种使用siRNA抑制靶mRNA表达的方法，该方法包含通过分析候选siRNA的核苷酸序列的相邻和非相邻部分之间的相对结合能模式，筛选预测的显示最大靶向抑制效率的互补siRNA的步骤，以及使用筛选的siRNA抑制靶mRNA表达的步骤。

背景技术

RNA干扰(以下称为“RNAi”)是指通过具有互补于靶mRNA的核苷酸序列的双链RNA(以下称为“dsRNA”)分解细胞质中的靶mRNA的现象。1998年，Fire和Mello首次在线虫(C.elegans)中发现RNA干扰现象后，在果蝇、锥虫(鞭毛虫纲的一种)和脊椎动物中也报道了RNAi现象的存在(Tabara H，Grishok A，Mello CC，Science，282(5388)，430-1，1998)。对人类来说，由于将dsRNA导入时诱导抗病毒干扰素途径，因而难以获得RNAi作用。2001年，Elbashir和Tuschl等人报道了将21个核苷酸长度的小分子dsRNA导入人细胞没有引起这种干扰素途径，却特异地分解互补的靶mRNA(Elbashir，S.M.，Harborth，J.，Lendeckel，W.，Yalcin，A.，Weber，K.，Tuschl，T.，Nature，411，494-498，2001；Elbashir，S.M.，Lendeckel，W.，Tuschl，T.，Genes & Dev.，15，188-200，2001；Elbashir，S.M.，Martinez，J.，Patkaniowska，A.，Lendeckel，W.，Tuschl，T.，EMBO J.，20，6877-6888，2001)。此后，21nt长度的dsRNA作为一种新的功能基因组学工具引起人们的注意，并被命名为小分子干扰RNA(以下称为“siRNA”)。该小分子干扰RNA(siRNA和microRNA)被认为是Science期刊在2002年度的最大突破(Jennifer Couzin，BREAKTHROUGH OF THE YEAR：Small RNAs Make Big Splash，JenniferCouzin，Science 20 December 2002：2296-2297)。

作为一种治疗学和功能基因组学的工具，siRNA比传统的反义RNA具有一些优势。首先，反义RNA需要合成许多种类的反义RNA，需要投入大量的时间和费用进行实验以获得有效的靶序列，而siRNA的效果可以通过一些算法进行预测，从而通过较少量的实验筛选更有效的siRNA。第二，与反义RNA相比，已知siRNA可在更低浓度有效抑制基因的表达。这意味着可使用较少量的siRNA进行研究并且有望获得更好的治疗效果。第三，通过RNAi的基因表达抑制是体内的自然机制，其作用非常特异。

通常，RNAi实验包括siRNA设计(靶点筛选)、细胞培养实验(细胞培养试验、靶mRNA降解速率、最有效siRNA的筛选)、动物实验(稳定性、修饰、输送、药代动力学、毒理学)和临床测试。这些实验中，最重要的步骤是筛选有效的siRNA序列，以及将筛选的siRNA输送到靶组织(药物输送)。筛选高效率的siRNA序列很重要，因为不同的siRNA显示不同的效率，而只有高效的siRNA才会带来准确的实验结果，并能用于治疗。通过计算机辅助评分法和实验方法筛选有效的核苷酸序列。所述实验方法的目的在于筛选与体外转录合成的靶mRNA具有良好结合的核苷酸序列。然而，由体外转录获得的mRNA结构可能不同于细胞中mRNA的结构，并且很多蛋白质可结合于细胞中的mRNA，从而使得利用体外转录的mRNA获得的实验结果不能反映真实的结果。因此，开发一种筛选有效siRNA序列的算法很重要，其可以通过考虑影响siRNA序列有效性的各种要素实现。