[发明专利]一种提高有机酸产量的重组微生物

说明书

美国政府支持声明

[0001]本发明是在美国能源部资助的No.DE-FC36-02GO12001合作协议的支持下完成。美国政府对本发明具有一定的权力。

相关申请的交叉引用

[0002]本申请根据35U.S.C.§119(e)，要求于2005年1月26日提交的美国分案申请第60/647,141号和于2004年12月22日提交的美国分案申请第60/639,443号中的利益，前述专利申请通过全部引用并入本发明。

背景技术

[0003]许多目前源于石油化学材料的化学品都可以从天然碳水化合物制备而来。特别是有可能成为高容量日用化学品的琥珀酸，一种四碳二羧酸，琥珀酸可以作为商业工艺过程的起始材料，用于产生消费用品工业上许多重要的中间体和精细化工材料。并且这些日用化学品目前依靠于来源于非可再生石油化工材料的源材料。例如，作为日用化学品的琥珀酸可以代替石油化工起始材料，用于制备1，4-丁二醇(BDO)和四氢呋喃(THF)化合物，而1，4-丁二醇(BDO)和四氢呋喃(THF)是许多工业中有用的溶剂和起始材料。例如，1，4-丁二醇(BDO)和四氢呋喃(THF)化合物用于生产汽车车身用树脂，家用电器用热塑材料和纺织业中莱卡等的弹性聚合物。此外，1，4-丁二醇(BDO)和四氢呋喃(THF)化合物在农业化工和制药工业中还有许多特殊的用途。值得注意的是，BDO的世界消费量正以每年4％的速度增长。

[0004]目前，用于生产BDO和THF的石油化学品包括乙炔、甲醛、丁烷、丁二烯和环氧丙烷。所有这些原料都具有各种不同的缺点，如极度易燃性、化学不稳定性和毒性。而且，由于这些材料都是来源于石油，会使不可再生资源耗尽。他们的处理或者破坏，最终会向大气中释放碳(以二氧化碳的形式)。因此，研制琥珀酸替代石油化工源原料可以减少有害原料的处理和储藏，提高工业和社区安全性，减少污染和环境成本，并减少对石油的依赖性。

[0005]通过糖发酵生产琥珀酸和其他有机化合物是一种经济可行的方法，许多微生物已经被用于以谷物糖作为碳源生产琥珀酸。这样，开发琥珀酸作为石油化工起始原料的替代品，将扩大那些可以提供发酵糖的谷物、其他农产品和/或生物量的市场。

[0006]正式地讲，制备琥珀酸的生物化学途径就是向三碳化合物磷酸烯醇式丙酮酸盐(PEP)上添加一个二氧化碳分子，产生四碳化合物草酰乙酸盐(OAA)。产生琥珀酸途径中的下一个步骤是反三羧酸循环(TCA循环)的一部分，包括两个专性还原步骤。在从OAA到琥珀酸盐的生化工艺中，OAA必须首先被还原产生L-苹果酸盐，L-苹果酸盐然后脱水产生延胡索酸盐和水。然后，延胡索酸盐被还原产生琥珀酸。在化学技术中，“还原”是指向化合物添加氢分子。

[0007]通常来讲，自由分子氢在细胞内生物系统中未发现存在。因此，还原反应是通过辅酶作为氢的生物化学等效物(即，作为分子氢的载体)来实现的，术语表述为“还原当量”。还原当量包括辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)、还原型黄素腺嘌呤二核苷酸(FADH₂)和还原型黄素单核苷酸(FMNH)。一般情况下，在一些微生物中，NADH和NADPH可以在吡啶二核苷酸转氢酶作用下相互转化。

[0008]将OAA转化为琥珀酸盐的还原当量通过NAD(P)H₂，FADH₂，或者其他辅助因子提供。在OAA转化为琥珀酸盐的反应中，必须保证足够量的还原当量。如果没有足够量的还原当量，生物化学途径就不会有效地进行，仅会有一部分OAA被转化为所需的琥珀酸盐。

[0009]还原当量在很多常见于细胞代谢的生物过程中都可以产生。例如，戊糖磷酸循环(PPC)过程中可以产生还原当量。在戊糖磷酸循环过程中，葡萄糖-6-磷酸在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的作用下，被转化为D-6-磷酸-葡萄糖酸-δ-内酯，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶也称间酶或者Zwf。NADP作为转化反应的一部分，被转化为NADPH，作为还原当量的受体。