[发明专利]由甲醛和氰化氢生产乙醇酸的方法

权利要求书

1.一种由甲醛和氰化氢生产乙醇酸的方法，包括：

(a)提供在可确定的一段时间加热至约90℃至约150℃温度的含水甲醛原料流；

(b)在适合乙醇腈合成的温度下，将(a)的加热的含水原料流与氰化氢接触，由此产生乙醇腈；

(c)在适合的含水反应混合物中，将步骤(b)的乙醇腈与包含具有腈水解酶活性的多肽的酶催化剂接触，所述多肽具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少一个选自以下的氨基酸取代：

(1)在氨基酸残基第168位用赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸或缬氨酸取代；和

(2)在氨基酸残基第201位用谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、丙氨酸、半胱氨酸或苏氨酸取代；由此产生乙醇酸；和

(d)以盐或酸的形式回收(c)中产生的乙醇酸；其中当在相同的反应条件下将乙醇腈转化为乙醇酸时，相对于敏捷食酸菌72W腈水解酶的腈水解酶活性，所述酶催化剂提供了至少1.5倍腈水解酶活性的增加。

2.权利要求1的方法，其中使用选自反应性溶剂萃取、离子交换、电渗析、聚合、热分解、醇解以及它们的组合的回收法回收乙醇酸。

3.权利要求2的方法，其中回收法选自离子交换和反应性溶剂萃取。

4.权利要求1的方法，其中在加热含水甲醛原料流之前，添加适量氢氧化钠到含水甲醛原料流中，其中氢氧化钠与甲醛的摩尔比率为约1∶50至约1∶2000。

5.权利要求1的方法，其中氰化氢与甲醛的摩尔比率为至少1.01至约1.15∶1。

6.权利要求1的方法，其中在约0℃至约70℃的反应温度下，加热的含水甲醛原料流与氰化氢反应。

7.权利要求6的方法，其中在约10℃至约30℃的反应温度下，加热的含水甲醛原料流与氰化氢反应。

8.权利要求1的方法，其中含水甲醛原料流包含约0.1wt％至约15wt％甲醇。

9.权利要求1的方法，其中所述氨基酸序列选自SEQ ID NOs：8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30和32。

10.权利要求1的方法，其中当在相同的反应条件下将乙醇腈转化为乙醇酸时，相对于敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)腈水解酶的活性，酶催化剂提供了至少约2倍腈水解酶活性的改善。

11.权利要求10的方法，其中当在相同的反应条件下将乙醇腈转化为乙醇酸时，相对于敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)腈水解酶的活性，酶催化剂提供了至少约4倍腈水解酶活性的改善。

12.权利要求1的方法，其中酶催化剂以完整的微生物细胞、透化处理的微生物细胞、微生物细胞提取物的一种或多种成分、部分纯化的酶或纯化的酶的形式存在。

13.权利要求12的方法，其中所述完整的微生物细胞是重组表达所述多肽的转化的微生物宿主细胞。

14.权利要求13的方法，其中转化的微生物宿主细胞选自：丛毛单胞菌、棒状杆菌、短杆菌、红球菌、固氮菌、柠檬酸杆菌、肠杆菌、梭状芽孢杆菌、克雷白氏杆菌、沙门氏菌、乳酸杆菌、曲霉、糖酵母、接合酵母、毕赤酵母、克鲁维酵母、假丝酵母、汉森氏酵母、杜氏藻、德巴利氏酵母、毛霉菌、球拟酵母、甲基杆菌、芽孢杆菌、埃希氏杆菌、假单胞菌、根瘤菌和链霉菌。

15.权利要求14的方法，其中转化的微生物宿主细胞是大肠杆菌。

16.权利要求15的方法，其中转化的微生物宿主细胞是选自具有国际保藏编号ATCC 47076的大肠杆菌MG1655和具有国际保藏编号ATCC 53911的大肠杆菌FM5的大肠杆菌菌株。

17.权利要求12-16任一项的方法，其中酶催化剂固定在可溶性或不溶性的支持物中或支持物上。

18.权利要求1的方法，其中在含水反应混合物中产生的乙醇酸铵的浓度为约0.02wt％至约90wt％。

19.权利要求18的方法，其中在含水反应混合物中产生的乙醇酸铵的浓度为约0.02wt％至约40wt％。