[发明专利]色谱介质

说明书

发明领域

本发明涉及用于分离和纯化各种生物分子如肽类、蛋白质类和抗体类的新的色谱介质、优选混合型聚合物色谱介质的制备和用途。更具体地说，本发明公开了新的色谱介质，优选是混合的阴离子交换剂、混合的阴离子-阳离子交换剂及疏水的交换剂。所述色谱介质通过将聚合物使用聚乙烯亚胺改性和将其官能化而制备。意外地发现，这些混合型聚合物介质提供了增强了的分离能力和蛋白质结合能力。

发明背景

文献中详细记载了通过离子交换色谱介质分析蛋白质混合物，例如PeteGagnon，“Purification Tools for Monoclonal Antibodies”，Validated Biosystems，Inc.,(1996)。最近，基于蛋白质药物和疫苗的发展，加大了对更大规模纯化蛋白质混合物的需要。非常期望离子交换色谱介质能够用于该领域。

制备这类色谱介质物质、特别是含伯胺和仲胺官能团的阴离子交换剂的一种方法是使用聚乙烯亚胺(PEI)覆盖多孔硅物质的内表面。例如，使用聚乙烯亚胺覆盖二氧化硅颗粒的内表面，接着通过交联固定，这已经公开于Alpert和Regnier,J.Chromatogr.185,375-392(1979)中，而且以该方式制得的物质在合成寡核苷酸的色谱分离中的应用已经描述在Lawson等人，Anal.Biochem.133，85-93(1983)中。

类似地，由聚乙烯亚氨基丙基-三甲氧基硅烷的共价结合获得的PEI覆盖的多孔硅颗粒或可控多孔玻璃颗粒的制品，已经公开于JT Baker ChemicalCo.的US 4,540,486中。该专利公开了通过PEI覆盖的二氧化硅与环状羧酸酐的反应，形成具有混合的弱碱性/弱酸性官能团的色谱树脂。已经表明，当这些物质在色谱柱中使用时，可以分离细胞色素C、α1-酸糖蛋白、卵清蛋白和β-乳球蛋白(弱碱性介质)的混合物或者卵清蛋白、细胞色素C、血红蛋白和溶菌酶(混合的弱碱性/弱酸性介质)的混合物。在免疫球蛋白G的纯化中，PEI衍生的多孔硅或其羧化型的效果已经在JT Baker Chemical Co.的US4,606,825中得到证实。

如JT Baker Chemical Co.在US 4,721,573中所述，上述PEI覆盖的二氧化硅的酰化形式通过引入磺基，可以进一步转化成混合的弱酸性/强酸性官能介质。使用这种磺酸化介质填充的柱子，可以分离细胞色素C、血红蛋白、溶菌酶和卵清蛋白的混合物，还可以分离杂交瘤细胞培养基中的蛋白质组分。

通过与单酰基氯或直链羧酸酐反应，PEI共价结合的二氧化硅颗粒还可以转化成疏水的色谱介质，其中酰基可以是直链烃链、苯基或取代的苯基。如JT Baker Chemical Co.在US 4,551,245中所述，使用丁酰氯以该方式制得的二氧化硅基质弱碱性/反相色谱介质，可以分离细胞色素C、肌红蛋白、溶菌酶、卵清蛋白和α-糜蛋白酶原。

在聚乙烯醇(PVA)臂的末端具有离子交换基团的琼脂糖珠已经在Amersham的WO 98/58732中被公开。然而，与本发明不同的是，PVA间隔臂既不赋予产物任何离子交换能力，其自身也不提供混合型产物中的一种官能性。

二氧化硅基质色谱填料的一个主要缺点是其在高pH下缺乏稳定性。对于涉及纯化药物的应用而言尤其如此，这是因为使用1N氢氧化钠处理设备是常规的灭菌操作。

发明概述

本发明提供了能够在高pH下降低或避免上述缺乏稳定性的色谱介质。本发明还提供了混合型色谱介质。已经发现，避免该不稳定性问题的一个可能方法是使用基于在聚合物表面上使用PEI衍生(即非交联)的聚合物载体的色谱填料，其表面衍生介质可以进一步通过官能化试剂与在聚合物树脂表面上的聚乙烯亚胺的末端氨基的反应官能化。根据本发明，优选可以提供混合型介质，例如具有混合的伯胺、仲胺和叔胺交换位点的介质、具有弱阴离子和弱阳离子交换位点的介质、具有弱阴离子、弱阳离子和强阳离子交换位点的介质、具有弱阴离子和疏水(反相)交换位点的介质、及具有弱阴离子和强阳离子的介质。此外，意外地发现，基于这种聚乙烯亚胺衍生的聚合且官能化的衍生物的色谱介质提供了不同和独特的分离特性。在本发明一方面，提供了用于生物分离的聚合物色谱介质。本发明不同于现有的聚合物色谱介质之处在于制备方法和介质特性，这是因为这些现有的色谱介质是简单的离子交换剂。另外，就制备方法、组成、用途和性能而言，本发明的介质不同于现有的二氧化硅基质介质。出人意料地，根据本发明制得的聚合物混合型介质具有提高了的分离和结合能力。