[发明专利]含有假异胞嘧啶核碱基衍生物的3’修饰寡核苷酸及其作为引物或探针的应用

说明书

本发明涉及核酸扩增，例如应用于聚合酶链式反应(PCR)的化合物和方法。

检测是否存在靶核酸在各种领域中起着重要作用，包括：医学诊断、法医学和遗传分析。PCR是核酸扩增方法的例子之一，其提供的高度灵敏方法通过选择性扩增靶核酸序列来检测是否存在靶核酸。

核酸扩增，例如PCR的重要问题是会产生非特异性扩增产物。会在PCR反应中造成问题的非特异性扩增过程的例子之一是“引物-二聚体”扩增。例如，当引物的3’末端区域与其自身或另一引物有一定程度互补时，会导致引物-二聚体扩增。这些引物能彼此杂交形成引物-二聚体。然后，引物-二聚体的扩增会产生引物-二聚体扩增子，进而用作进一步扩增的模板。这种过程的后果之一是消耗了引物，从而导致灵敏度降低或者甚至不能扩增所需的靶核酸。

熟知在PCR反应期间加入过量的引物使得甚至3’末端区域的弱互补性亦会产生引物-二聚体扩增子，从而使该问题愈加复杂。因此，需要开发能抑制扩增反应，例如PCR中引物-二聚体形成的试剂和方法。

本文出乎意料地发现在引物的3’末端区域掺入某些修饰的核碱基(nucleobase)对扩增反应期间的引物-二聚体扩增子形成有有益影响。

在一些实施方式中，本发明提供的多核苷酸在离该多核苷酸3’末端不超过4个核苷酸处含有至少一个嘧啶核碱基，其中所述修饰的嘧啶核碱基具有以下结构：

其中R选自-H、-F、-Cl、氰基、硝基、C₁-C₆烷基、C₁-C₆取代的烷基、C₃-C₁₀芳基、C₃-C₁₀取代的芳基、C₃-C₁₀芳基醚、C₃-C₁₀取代的芳基醚、-CF₃、胺、取代的胺、C₃-C₆环状烷基、C₃-C₆取代的环状烷基、苯基、取代的苯基和杂芳基。

在一些实施方式中，R可以是-H。在一些实施方式中，R可以是C₁-C₆烷基。在一些实施方式中，R可以是C₁-C₆取代的烷基。在一些实施方式中，R可以是C₃-C₁₀芳基。在一些实施方式中，R可以是C₃-C₁₀取代的芳基。在一些实施方式中，R可以是-CF₃。在一些实施方式中，R可以是氨基。在一些实施方式中，R可以是取代的氨基。在一些实施方式中，R可以是C₃-C₆环状烷基。在一些实施方式中，R可以是C₃-C₆取代的环状烷基。在一些实施方式中，R可以是苯基。在一些实施方式中，R可以是取代的苯基。在一些实施方式中，R可以是杂芳基。在一些实施方式中，R可以是氰基。在一些实施方式中，R可以是硝基。

在一些实施方式中，所述至少一个修饰的嘧啶核碱基离多核苷酸3’末端不超过3个核苷酸。在一些实施方式中，所述至少一个修饰的嘧啶核碱基离多核苷酸3’末端不超过2个核苷酸。在一些实施方式中，所述至少一个修饰的嘧啶核碱基是多核苷酸的3’末端核苷酸。

在一些实施方式中，本发明多核苷酸可以是引物。在一些实施方式中，本发明多核苷酸在3’-末端可延长。

在一些实施方式中，本发明多核苷酸可包含可检测标记、猝灭剂或小沟结合剂中至少一个。在一些实施方式中，本发明多核苷酸可用作探针。

在一些实施方式中，本发明提供引物延伸的方法，包括将多核苷酸引物与变性DNA模板退火，从而使该多核苷酸引物与该变性DNA模板一条链上的互补多核苷酸序列退火以形成引物-模板复合物；和延伸该引物-模板复合物的引物部分以形成双链扩增子，其中所述多核苷酸引物是本发明引物。

在一些实施方式中，本发明提供引物延伸方法，包括在延伸步骤后使双链扩增子变性。在一些实施方式中，可重复退火、延伸和变性步骤至少1次。在一些实施方式中，可重复退火、延伸和变性步骤至少10次。在一些实施方式中，可重复退火、延伸和变性步骤至少20次。在一些实施方式中，可重复退火、延伸和变性步骤至少30次。在一些实施方式中，可重复退火、延伸和变性步骤至少40次。