[发明专利]利用sHSPs制备目的蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种目的蛋白的分离和纯化方法、目的蛋白的制备方法、以及通过全细胞酶或部分纯化酶来进行生物转化的方法，其中添加了有效量的sHSPs(小热休克蛋白)以防止蛋白酶降解目的蛋白。

背景技术

由于重组DNA技术的显著发展，使得通过E.coli、酵母、真菌、植物、动物以及昆虫细胞大量生产可供于医用和工业用上的蛋白成为可能，而从自然界中仅能少量地获取这些蛋白。例如，已经成功的利用重组E.coli生产诸如干扰素、白介素2、集落刺激因子、生长激素、胰岛素样生长因子以及人血清白蛋白等蛋白质(Lee.SY，Trends Biotechnol.，14：98，1996)。特别地，很好地建立了E.coli的高密度细胞培养技术，其中可以以较高的产率大规模地生产目的蛋白，从而降低目的蛋白生产的成本。然而，即便可以通过有效的载体表达系统来大量生产有用蛋白，如果没有建立较好的蛋白分离和纯化系统，蛋白的最终产率会迅速降低。在蛋白合成较为困难、费时费力或者蛋白本身产量较小的情况下，该分离和纯化步骤就显得尤为重要。

蛋白的分离和纯化通常包括如下步骤：(1)细胞抽提：用玻璃匀浆器、混合器、polytron和超声仪等仪器来破坏细胞或组织，随后通过离心方法分离；(2)溶解：当要分离和纯化不溶性蛋白时，首先，需要将蛋白溶解。采用不同性质的表面活性剂(SDS、曲拉通X-100、诺乃洗涤剂P-40、CHAPS等)作为溶解生物细胞膜蛋白的试剂；(3)蛋白的分离、浓缩和透析：在纯化蛋白样品之前采用基于蛋白溶解性的硫酸铵沉淀法，基于蛋白分子量不同的分子量截留法，基于多孔纤维素膜的透析法等方法；以及(4)蛋白的最终纯化：因为纯化蛋白的方法如下表1那样是多种多样的，那么就需要根据实验的目的和材料类型对各种方法进行组合从而实现纯化。一般来说，在初始步骤中，需要具有大量处理能力的方法，即便其分离能力在某种程度而言是较低的，而随着最后步骤的临近则需采用具有高分离能力的方法。

表1：纯化蛋白的典型方法

  方法    特征    类型 柱色谱-通过压力(或通量)分离-分离大量蛋白-LPLC(低压液相色谱)-HPLC(高压液相色谱) 亲和色谱-利用特定物质(配基)和蛋白之间的亲和性的色谱-高纯度和高回收率-采用抗体柱的亲和色谱-采用谷胱甘肽柱的GST融合蛋白的亲和色谱-蛋白特异性亲和色谱 其它色谱-通过蛋白所带电荷(等电点)、生理活性(化学反应能力)、分子量、疏水性进行分离-离子交换色谱-凝胶过滤-反相色谱-疏水层析 电泳-通过高分辨率电泳进行分离-等电聚焦-SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳-二维凝胶电泳