[发明专利]通过OmpF和目的蛋白的共表达的目的蛋白细胞外生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种向细胞培养基中分泌和生产目的蛋白的方法，并且更特别地，包含E.coli外部膜蛋白F(OmpF)的重组表达载体跟微生物的共转化以及在细胞培养基中分泌含有目的蛋白的重组表达载体，以及通过培养所述微生物在细胞培养基中分泌和生产目的蛋白的方法。

背景技术

随着基因处理技术的发展，通过使用细菌和各种动物和植物研究生产大量有用蛋白已经频繁进行。至今为止，E.coli作为一种宿主细胞通常主要用作多种有用蛋白的批量生产，研究也还是主要集中在这里(Choi等，Chem.Eng.Sci.，66：876，2006；Lee，Trends Biotechnol.，14：98，1996)。然而，如果将待生产的有用蛋白在E.coli的细胞质中生产，还是会存在许多问题。首先，为了在细胞质中生产蛋白要进行分离和纯化以获得高纯度，这要进行相当复杂和昂贵的分离和纯化步骤。并且，上述蛋白易于曝露于当前细胞质中的多种蛋白酶中，这将导致减少产量。还有，在大多数情况下，蛋白在细胞质中的过表达并不能完全折叠并形成不活动的包涵体。因为这些包涵体蛋白没有作为蛋白质的活性，为了从所述包涵体蛋白中获得生物活性和水溶性的蛋白质需要进行复杂和昂贵的变性和再折叠步骤(Choi等，Chem.Eng.Sci.，66：876，2006)。

作为解决类似问题的方法之一，存在一种方法其在细胞质中生产的蛋白质被分泌到外周胞质或细胞培养基中。E.coli中的目的蛋白的细胞外生产有多种优点。首先，在E.coli细胞中的目的蛋白的生产可以根本地防止细胞内蛋白裂解，以至于可以得到预期蛋白质的固定生产。其次，通过分泌步骤可以使蛋白质得到正确的折叠以生产具有活性的蛋白质，并可以防止由非正确折叠导致的包涵体的形成。第三，通过分泌步骤，去除N端分泌信号序列以至于可以保持同样的氨基酸序列作为自然出现的不带有N端的蛋氨酸(Met)残基序列，蛋氨酸不可避免地在细胞内生产中连接上来。最后，纯化步骤很容易实施。由于很少或几乎没有蛋白质可以从E.coli天然地分泌到培养基中，细胞培养基中的目的蛋白分泌生产允许目的蛋白维持在高纯度，因此从细胞培养基中纯化分离目的蛋白变得非常容易。尽管在E.coli中的目的蛋白的细胞外生产同分泌到E.coli外周胞质中一般的分泌生产具有相似的优点，但是上述细胞外生产的优点在工业生产上可以更有效。因为所述细胞外分泌生产是一种将目的蛋白完全分泌在细胞外部的方法，而不是将目的蛋白分泌在有限的外周胞质中，它可以显著减少导致蛋白过表达的细胞中的负担以允许通过高细胞浓度培养基和连续培养基大量生产蛋白质。尽管两种方法可以使高纯度的蛋白质在纯化步骤中进行生产，但是将目的蛋白生产分泌在外周胞质中比细胞外分泌生产需要更复杂的步骤，它不易用于工业应用(Choi和Lee，Appl.Microbiol.Biotechnol.，64：625，2004)。如上所述，细胞外分泌的优点非常突出和多样化并因此有许多研究实施将E.coli中的目的蛋白在外周胞质或细胞外分泌。

在重组蛋白生产方面，在外周胞质或细胞培养基中分泌分析自E.coli的有用蛋白的方法具有多种优点。首先，因为外周胞质或培养基比细胞质包括显著较少量的蛋白质，它非常易于分离和纯化预期有用的具有高纯度的蛋白质。而且，因为有用的蛋白质分离自含有大部分蛋白酶的细胞质，细胞内的蛋白分解可以被预先防止，这样在产量方面得到好的结果。而且，因为外周胞质是一个比细胞质更易被氧化的环境，二硫化物更容易被键接，由此得到具有准确折叠的蛋白质生产，它导致包涵体蛋白的形式显著减少(Choi和Lee，Appl.Microbiol.Biotechnol.，64：625，2004)。

为了分泌E.coli不分泌的外部蛋白质，在先已知的分泌信号序列(例如OmpA，OmpF，PhoA，SpA，等)连接到外部蛋白质的N端末端或在经过一些修饰后进行连接(Abrahmsen等，EMBO J.，4：3901，1985；Choi和Lee，Appl.Microbiol.Biotechnol.64：625，2004；Jobling等，Plasmid，38：158，1997；Klein等，Protein Eng.，5：511，1992；Utsumi等，Gene基因，71：349，1988)。