[发明专利]糖基化干扰素－β的制备方法

权利要求书

1.一种糖基化重组人干扰素-β的生产方法，包括在无血清培养基中培养人干扰素-β生产细胞的步骤，该无血清培养基包括：

-大约10-30mM HEPES，优选20mM HEPES；

-大约0.5-3mM脯氨酸，优选大约1mM脯氨酸；和

-大约5500-7700mg/L氯化钠，优选大约6100mg/L氯化钠。

2.根据权利要求1的方法，所述的无血清培养基进一步包括大约10-20mg/L酚红，优选大约15mg/L酚红。

3.根据前述任一权利要求的方法，该方法包括生长阶段I、生长阶段II和生产阶段，其中，生长阶段I在大约37℃进行，生长阶段II在大约35℃进行，生产阶段在大约33℃进行。

4.根据前述任一权利要求的方法，其中该方法是灌流式方法，稀释率大约为1-10/天，优选为大约1.5-7/天。

5.根据权利要求4的方法，其中稀释率在细胞培养最初的2-3周从初始值的大约1-2/天增加大约7-10/天。

6.一种从液体纯化重组人干扰素-β的方法，优选液体为细胞培养上清液，该方法包括步骤：

a)使液体经过亲和层析；

b)使亲和层析的洗脱液经过阳离子交换层析；

c)使阳离子交换层析的洗脱液经过RP-HPLC进行疏水层析。

7.根据权利要求6的方法，包括，在步骤(a)之前，通过过滤使液体澄清的步骤。

8.根据权利要求6或7的方法，进一步包括步骤：

d)进行超滤和透析；

e)使透析液经过分子排阻色谱；

f)使分子排阻色谱的洗脱液经过微孔过滤。

9.根据权利要求6-8的任一权利要求的方法，其中步骤(a)在蓝色琼脂糖上进行，步骤(b)在羧甲基琼脂糖上进行。

10.根据权利要求1-5的任一权利要求的方法，还实施根据权利要求6-9的任一权利要求的方法。

11.根据权利要求10的方法，进一步包括将纯化的干扰素-β制成药学组合物的步骤，任选地和一种药学上可接受的载体一起掺合。

12.一种由前述任一权利要求的方法获得的糖基化的重组干扰素-β组合物。

13.根据权利要求12的干扰素-β组合物，包括含有2个或3个岩藻糖的寡糖结构。

14.根据权利要求12或13的干扰素-β组合物，其中所述的寡糖结构含有一个唾液酸二天线三岩藻糖化的糖(NeuAc2.Hex5.HexNAc4.Fuc3)。

15.根据权利要求12-14的任一权利要求的干扰素-β组合物，进一步包括一个或多个以下的寡糖结构：

-非唾液酸化的二天线结构(Hex5.HexNAc4.Fuc)；

-具有N-乙酰半乳糖胺重复结构的二唾液酸化的三天线结构或二唾液酸化的二天线结构(NeuAc2.Hex6.HexNAc5.Fuc)；

-三唾液酸化的三天线结构(NeuAc3.Hex6.HexNAc5.Fuc)；

-具有N-乙酰半乳糖胺重复结构的三唾液酸化的三天线结构或三唾液酸化的四天线结构(NeuAc3.Hex7.HexNAc6.Fuc)；

-具有两个岩藻糖单位的单唾液酸化的和二唾液酸化的二天线结构(NeuAc.Hex5.HexNAc4.Fuc2，NeuAc2.Hex5.HexNAc4.Fuc2)。

16.根据权利要求12-15的任一权利要求的干扰素-β组合物，其特征在于唾液酸化形式包括大约1-5％非唾液酸化的N-糖链，大约5-25％单唾液酸化的糖链，大约55-75％二唾液酸化的N-糖链，和大约10-25％三唾液酸化的N-糖链。

17.根据权利要求12-16的任一权利要求的重组人干扰素-β组合物在制备治疗多发性硬化症的药物中的应用。

18.根据权利要求17的应用，其中的多发性硬化症选自复发性多发性硬化症、非复发性多发性硬化症和早期发病的多发性硬化症。