[发明专利]从间叶干细胞产生心脏细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及适用于细胞治疗的心肌细胞及产生所述细胞的方法。更具体地，本发明提供一种产生心肌细胞的方法，包含将骨髓间叶干细胞培养在含有抗坏血酸的培养基中。

背景技术

间叶干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)属于多能型(multipotent)或有限潜能型干细胞，其可分化成为至少一种以上源自间叶细胞谱系的细胞，例如脂肪细胞、心肌细胞及骨骼肌细胞(Galmiche等，(1993)Blood 82：66-76；以及Wakitani等，(1995)Muscle Nerve 18：1417-1426)。因此，越来越多的研究希望能将MSCs用在各种疾病、异常以及失能的治疗上，因为MSCs可取自自体提供细胞或组织充分的更新细胞来源，无免疫排斥作用；而且MSCs不像胚胎干细胞，当以MSCs进行治疗时，不会引起道德伦理上的争议。

已知可通过诸如5-氮杂胞苷(5-azacytidine)之类的DNA去甲基剂(DNAdemethylation agent)或通过与老鼠心肌细胞共同培养的方式，来使骨髓间叶干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)分化成为具有心脏功能的心肌谱系细胞(cardiomyocyte-linage cells)。但是，5-氮杂胞苷本身具有细胞毒性，而采用与老鼠心肌细胞共同培养的方式却可能使将来接受细胞移植的个体，受到异种污染的威胁。因此，提出以下数种改良的方法。

WO 2004/065589 A1揭示一种产生可供移植到心脏组织内的细胞的方法，其实施例1揭示先将分离出来的骨髓干细胞培养在一种可维持细胞自我更新能力且不会丧失其对分化剂(例如，生长因子)的反应性的培养基中，其包含10％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、100μM的L-抗坏血酸-2-磷酸盐、5-15ng/ml的白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)及20nM的地塞米松(dexamethasone)。再将骨髓干细胞培养在一种内含多种生长因子(50ng/ml的bFGF及25ng/ml的BMP-2)及IGF-1(2ng/ml)的培养基中2周，以诱发其分化成为心肌细胞。

WO 2005/056779揭示一种制备可供移植到哺乳动物心脏组织内的细胞的方法，其包含将骨髓干细胞培养在一种心脏专一性培养基中，所述心脏专一性培养基包含bFGF、BMP-2及IGF-1，且较佳是包含浓度各为200ng/ml的bFGF、BMP-2及IGF-1，且更包含2％至20％的FBS、1-1000μM的L-抗坏血酸-2-磷酸盐、5-15ng/ml的LIF及1-200nM的地塞米松(dexamethasone)。

美国专利第6,387,369号揭示一种在体内产生心肌细胞的方法，其是在诸如人个体的心脏中施用能产生足够量心肌细胞的间叶干细胞。所述间叶干细胞是以一种可注射到心脏的液体或是一种在注射后会变成固体或半固体基质的细胞制备物形式来施用。同时，6,387,369号专利说明书中也提示以生长因子及分化剂来处理间叶干细胞的步骤，以及将间叶干细胞暴露在机械刺激及电刺激下，以使其分化成为心肌细胞的方法。但是，其说明书中并未明确揭示适用的生长因子和/或分化剂种类。

Shim等人(Shim等，(2004)BBRC 324：481-488)揭示一种内含胰岛素、地塞米松及抗坏血酸的心脏分化培养基的用途，并以细胞是否会表达心肌细胞专一性蛋白质的方式来确认该分化的培养基的功效，这些心肌细胞专一性蛋白质包括第I型心肌钙蛋白(cardio troponin I)、原肌球蛋白(tropomyosin)及肌联蛋白(titin)。