[发明专利]无致突变作用的抗菌多肽

说明书

技术领域

本发明属于多肽技术领域，特别涉及可用于制备抗菌组合物的无致突变作用的抗菌多肽、其制备方法及含有抗菌多肽的复合物。

背景技术

所有的生物，从病毒到人类，其蛋白质都是由20种氨基酸组成。多肽是一类由氨基酸构成但又不同于蛋白质的中间物质。多肽中的氨基酸彼此以称肽键连接。一种肽含有的氨基酸少于10个的肽称为寡肽，超过10个氨基酸以就称为多肽。氨基酸在50多个以上的多肽称为蛋白质。

由于越来越严重的对现有抗菌素耐药性问题，开发和研究新的抗菌素成了医学界的一个重要课题。除此之外，人们在研究生物的对外防御机制时发现一类多肽具有抗菌作用。因此引起了医药界对多肽抗菌素研究和开发的极大兴趣。40年代发现第一个抗菌肽，从此，多肽的抗菌作用也引起了研究者的高度重视。比如，Steiner et al(1981)发现从cecropia口腔分离出的抗菌多肽可造成细菌的裂解。Zasloff(1987)发现了Magainins。More(Mor et al.，1991)发现dermaseptins也可以使哺乳类动物细胞裂解。这两种多肽均可从蛙的皮肤组织中提取。多肽Venom melittin(1967)和neurotoxin pardaxin(1988)均可造成细胞和细菌的代裂解。最初大多抗菌多肽在动物组织中发现。在这些组织中起到防御作用，并可抑制微生物的复制(Boman，1995)。

多肽抗菌素不同于传统的抗菌素，抗菌肽作用专一，能从核酸和基因的角度去发挥作用。

1980年，瑞典科学家G.Boman等人发现了多肽的抗菌作用。后来，人们从细菌、真菌、两栖类、昆虫、高等植物、哺乳动物乃至人类中发现并分离出有抗菌活性的多肽。将其称为“antibactetial peptides，ABP”，即抗菌肽。但在后来又发现某些抗菌肽对部分真菌、原虫、病毒及癌细胞等均具有杀伤作用，便又称其为“peptide antibiotics”即多肽抗生素(Shai，et al.，U.S.Patent，7001983，2006；Paradies.U.S.Patent Documents，4874850，1989；Jacob et al.，U.S.Patent，5635479，1997；Maloy，U.S.Patent，1998；Lee et al，5889148，1999；WO，97-02286，1997)。天然抗菌肽通常是由30多个氨基酸残基组成，水溶性好，分子量大约为4000道尔顿左右。大部分抗菌肽具有热稳定性，在100℃下加热10～15分钟仍能保持其活性。多数抗菌肽的等电点可大于7，表现出较强的阳离子特征(Peptide Antibiotics：Discovery，Modes of Action and Applications edited by Christopher J.Dutton et al1998-2005 Culinary and Hospitality Industry Publications Services)。同时，抗菌肽对较大的离子强度和较高或较低的pH值均具有较强的抗性。此外，部分抗菌肽尚具备抵抗胰蛋白酶或胃蛋白酶水解的能力。一般认为抗菌肽杀菌作用主要是通过破坏细菌的细胞壁的完整性。并能造成细胞桨内物质溢出胞外而死亡。抗菌肽先由静电吸引而附于细菌膜表面，疏水性的C端插入膜内疏水区并改变膜的构象，多个抗菌肽在膜上形成离子通道而导致离子的溢出而死亡。抗菌肽可使膜蛋白凝聚、失活，引起膜渗透性改变而导致细菌死亡。不同类别的抗菌肽作用机理可不一样。抗菌肽多数具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌等特点。某些抗菌肽对部分真菌、原虫、病毒及癌细胞等均具有强有力的杀伤作用。抗菌肽对革兰氏阴性及阳性细菌均有高效广谱的杀伤作用。国内外已报道抗菌肽对至少有100种以上的细菌有杀伤作用。具有螺旋结构的线性多肽cecropins是第一个被发现的动物抗菌肽，1980年，由Boman等从美国天蚕蛹中分离得到。该类多肽抗生素一般含有37～39个氨基酸残基，不含半胱氨酸，其N端区域具有强碱性，可形成近乎完美的双亲螺旋结构，而在C端区域可形成疏水螺旋，两者之间有甘氨酸和脯氨酸形成的铰链区，多数多肽的C端被酰胺化，酰胺化对其抗菌活性具有重要作用。此后，人们相继从家蚕、柞蚕、果蝇、麻蝇中分离到了cecropins类抗菌肽。1989年，Lee等人从猪小肠中分离到了cecropin P1，说明了cecropins可能在动物中广泛存在。cecropins对革兰阳性菌、阴性菌组具有很强的杀伤力，而对真菌和真核细胞没有毒性。目前cecropins已被人工合成并已商品化。Magainins也是较早发现的一类抗菌肽。1987，Zasloff最先从两栖动物蛙(African clawed frogXenopus laevis)的皮肤中发现magainins具有抗真菌和抗菌作用。含有23个氨基酸，并在水溶性的条件下具有抗菌作用。他因此成立了一家公司开发该产品。它不仅对革兰氏阳性菌和革兰阴性菌有杀伤作用，对真菌及原虫亦有杀伤作用Zasloff，1987；Hancock，1998)。另外一组抗菌多肽叫Defensins，它是一类动物细胞内源性杀菌多肽，是从吞噬细胞中分离出来的，具有很宽的抗菌谱，对革兰氏阳性菌的杀伤作用大于对革兰阴性菌的杀伤作用，它也作用于真菌和部分真核细胞。但是对革兰阴性菌的活性比cecropins要低10倍左右(Dorschner RA，et al.，2006)。Apidaecins是从蜜蜂中分离得到的含某种氨基酸的线性多肽。Maloy和Kari UP(1995)发现含脯氨酸的另一类多肽抗生素。一般含有16～18个氨基酸残基，其中脯氨酸含量高达33％，精氨酸含量可达17％。apidaecins对某些革兰阴性菌具有很强的活性，而对革兰阳性菌不起作用。Apidaecins对某些革兰阴性的植物病原菌和肠杆菌科的致病菌的高杀伤力，但会产生神经原毒性作用。然而它只在植物抗细菌病基因工程和食品工业中有着很好的应用前景。还有一种叫作Drosocin抗菌肽(Otvos L Jr，2002)。它是来源于果蝇的一种富含脯氨酸的抗菌肽，在结构上与apidaecins具有一定的相似性，但是在其11位的苏氨酸羟基上连接着一个O-二糖链(-N-乙酰半乳糖胺-半乳糖)。它可能会影响蛋白质的合成和代谢(Otvos，2002)。Coleoptericin和hemiptericin分别来源于鞘翅目和半翅目昆虫，一级结构中富含甘氨酸，分子量一般较大(Imamura M，et al，1999；CociancichS et al.，1994)。但是，由于缺乏对其抗菌作用的研究，目前尚无开发商。Oppenheim等人从人的腮腺和下颌腺分泌物中分离得到了一组富含组氨酸的抗菌肽，长度在7～38个氨基酸残基不等，被称为histatins。对于引起口腔感染的多种微生物具有活性(Raj PA and Dentino AR.，2005)。Indolicidin是来源于牛中性粒细胞的多肽抗生素，因其13个氨基酸中含有5个色氨酸而得名。其C端是酰胺化的，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都具有很强的杀菌活性(Shaw JE.，et al.，2006)，但会产生耐药性(Samuelsen O.，et al.，2005)。含有一个二硫键的多肽，这是一类数量很少的抗菌肽，第1个被发现的这类多肽是bactenecin，来源于牛中性粒细胞。其12个氨基酸中含有4个精氨酸，在其第2位和第11位氨基酸残基间形成二硫键。bactenecin对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有活性(Raj PA and Dentino AR.，2005)。这类多肽中还包括一些来源于蛙类皮肤的多肽抗生素，一般在C端有一个由7个氨基酸形成的“loop”和一个长的N端“尾巴”，如brevinin-1，brevinin-2。含有两个或两个以上二硫键的多肽，这类多肽的典型代表是defensins，最初发现的defensins来源于哺乳动物的组织中，一般含有29～34个氨基酸残基，其中6个保守的半胱氨酸形成3个分子内二硫键；此外，其第6位和第15位的精氨酸，第24位的甘氨酸也是保守的。α-defensins可形成3层的β片层结构，通过3个二硫键和Arg-6与Glu-24之间的盐桥而被稳定。目前，defensins已被合成并已商品化。Defensins对多种细菌和某些真菌具有杀伤作用，并且对真核细胞有一定的毒性。defensins对革兰阳性菌的活性比革兰阴性菌强。defenssins的活性比cecropins弱，并且通常在低离子强度下起作用。β-defensins比α-defensins大一些，一般含有38～42个氨基酸残基。都含有3个二硫键和4～8个精氨酸。昆虫defensins在C末端与α-defensins相似，但是只有两个β片层结构，中间有一段α螺旋起稳定作用，主要对革兰阳性菌起作用，而对真菌没有作用。植物defensins一般有45～54个氨基酸残基，可形成4个二硫键，3个β片层结构和一个α螺旋结构。植物defensins一般只对真菌起作用而对细菌没有作用。不同植物defensins对真菌的抗菌谱不同。Thionins也是一类来源于植物的多肽抗生素，含有45～47个氨基酸残基，有6个或8个半胱氨酸形成的3个或4个二硫键。其二级结构可形成2个反平行的α螺旋结构和2个反平行的β片层结构。thionins抑制多种植物致病细菌和真菌，但是对假单胞菌属和欧文氏菌属的细菌不起作用(Castro andFontes，2005)。因此，很少有与人体细菌有关的研究。科学家们阐明了另外一种叫做抗菌肽J25(microcin MccJ25)天然小分子的复杂抗菌机制，这种抗菌肽能够阻断细菌的酶，有可能导致新一代抗生素的出现。MccJ25稳定的结构使之可以耐受各种极端环境，它有可能成为一种消毒剂。尽管MccJ25能够抑制细菌的RNAP从而杀死细菌，但是它并不能抑制人类的RNAP，因此不会危害人体细胞。不过，MccJ25也有一些缺点，它仅作用于大肠杆菌和相关的菌属，而且细菌很容易产生抗性。目前，所有的常规抗生素都出现了相应的抗药性致病株系，致病菌的抗药性问题已经日益严重地威胁着人们的健康。寻找全新类型的抗生素是解决抗药性问题的一种有效途径。抗菌肽因为抗菌活性高，抗菌谱广，种类多，可供选择的范围广，靶菌株不易产生抗性突变等原因，而被认为将会在医药工业上有着广阔的应用前景。目前，已有多种多肽抗生素正在进行临床前的可行性研究。