[发明专利]病原诱导启动子POsDR3及其在改良水稻抗性中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及一段水稻DNA片段的分离克隆、功能验证及应用。所述的DNA片段包含一个水稻抗病相关基因的启动子，它能够在病原物的诱导下特异性地驱动基因表达；它也能够在植物激素和化学信号分子的诱导下特异性地驱动基因表达。将该片段与抗病基因融合后转入水稻，遗传转化植株在病原物诱导下可以特异地表达抗病基因，其抗病性增强。

背景技术

植物在生长的过程中，会受到多种病原物如病毒、细菌、霉菌和线虫等的侵害。病原物侵入植物导致两种结果：(1)病原体在寄主植物内繁殖，引起相关的病害；(2)寄主植物产生抗病反应，杀死病原物或阻止其生长。利用抗性基因资源改良植物的抗病性，是预防病害同时又保护环境的根本出路。

采用转基因技术将抗性基因导入植物是目前改良农作物抗病性的主要途径之一。但是目前的遗传转化体系存在一些不足，很重要的一点便是转化载体中的启动子大多是组成型表达启动子。这不仅造成了植物体的负担，使植物在不需要发生抗病反应时表达额外的蛋白，造成了浪费；严重的还造成了植物体生理和代谢的紊乱，致其产生变异或死亡(Ehsani等，2003；Karlowski等，2003；Miyao等，2003；Durrant和Dong，2004)。

为了解决以上问题，申请人试图使用特异性启动子调控目标基因的表达。启动子是一段对基因的表达起调控作用的DNA片段。启动子在原核生物和真核生物中均存在，它是一段对基因转录的时间，空间和表达量起调控作用的DNA序列。在原核和真核生物中，启动子的结构有所不同。真核生物有三种RNA聚合酶，每一种都有其识别的不同启动子。RNA聚合酶II负责蛋白质基因和部分snRNA基因的转录，结构最为复杂。人们比较了上百个聚合酶II识别的真核启动子的序列，发现了一些共同的结构。如1)帽子位点，即转录起始位点，其碱基大多为A，两侧各有若干个嘧啶核苷酸，其中A为转录起点。2)TATA框，又称Hogness框或Goldberg-hogness框，其一致序列为：TATAAAA或TATATAT，而在它的两侧由富含G和C碱基对的序列组成，一般都位于-35bp附近。TATA框决定了转录起始点的选择，它是RNA聚合酶和DNA链结合的部位。3)CAAT框，其一致序列为GGC(T)CAATCT。一般位于-75bp附近，该框的碱基一旦缺失或突变，将会造成转录效率的急剧降低，CAAT框可能控制着转录起始的频率。4)增强子(enhancer)，又称为远上游序列，一般都在-100bp以上，它对依赖和不依赖TATA框的转录均有增强转录的作用。

特异性的启动子分为二类，一是受诱导表达的特异启动子，二是组织特异性表达的启动子。诱导型的启动子对外界的某些物质，如病原物，化学物质或逆境作出反应，启动植物体内相应的基因表达。组织特异型的启动子则驱动基因在特定的组织中表达。特异性的启动子可避免基因过量表达对植物体产生伤害。因此，利用水稻来源的病原物诱导表达的启动子驱动抗性基因的表达，是改良水稻抗性的最佳选择之一。

发明内容

本发明的第一个目的是从水稻中分离克隆一个抗病相关基因启动子区的DNA片段，对其功能进行验证，利用这个启动子调控抗性基因的表达，从而改良水稻的抗病性。这个启动子被命名为P_OsDR3(promoter of Oryza sativa defense responsive gene 3)。

本发明的第二个目的是将所克隆的启动子在培育转基因水稻中的应用。该转基因水稻在病原物诱导下可以特异地表达抗病基因，使其抗病性增强。

本发明涉及分离和应用水稻抗病相关基因OsDR3启动子的DNA片段(P_OsDR3)。该片段包含对病原、多种激素和化学信号分子产生应答反应的元件。其中，所述片段如序列表SEQ IDNO：1所示，或者基本上相当于SEQ ID NO：1所示的DNA序列，或者其功能相当于SEQ IDNO：1所示序列的亚片段。

可以采用已经克隆的P_OsDR3启动子作探针，从基因组文库中筛选得到本发明的启动子或同源的启动子。同样，采用PCR(polymerase chain reaction)技术，也可以从基因组中扩增得到本发明的P_OsDR3启动子以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA。采用以上技术，可以分离得到包含P_OsDR3的序列，将这一序列与基因连接并与合适的载体连接，可以转入植物细胞，产生转基因植物。