[发明专利]磷测定试剂

说明书

技术领域：

本发明属于生物试剂技术领域。具体涉及一种酶法测定磷试剂。

背景技术：

人体内含有磷(phosphorus)约17mol(530g)。其中87％存在于骨骼中。其余在软组织细胞内。体内许多重要的物质如某些蛋白质、脂类化合物、核酸、辅酶等都含有磷，在酸碱平衡中，磷酸盐亦具有重要作用。

血液中的磷可分为4部分。即：①无机磷：以H₂PO₄^-和HPO₄^2-的形式存在。②有机磷或磷酸脂：如磷酸核苷酸，磷酸已糖。③含磷脂类：如卵磷脂、脑磷脂、鞘磷脂。④少量其他磷化合物。

血液中的磷与骨骼中的磷维持动态平衡。体内的磷主要以磷酸基形式参与许多对生命活动非常重要的物质代谢。例如：构成磷脂，进而与蛋白质构成细胞的组成成分，参与能量代谢。尤其是氧化磷酸代谢过程，形成ATP等，参与DNA、RNA以及许多辅酶的构成，磷还作为某些酶的激活剂或仰制剂，参与多种酶促反应，糖、脂类蛋白代谢过程中许多生化反应。。

目前，由于人体的磷还无法直接测定，所以无机磷的检测实际上是分析磷酸盐阴离子(H₂PO₄^-，HPO₄^2-)。常用的方法有染料结合法，同位素稀释质谱法，原子吸收法，酶法等。磷钼酸非还原法(直接紫外线法)在340nm直接测定磷钼酸聚化合物。方法简单，便于自动化。但该方法在黄疸，溶血，脂血血清在340nm处有光吸收，必须做标本空白，否则会偏离。

丁源圻报告“CV-多元络合体系光度法”是当前已知测磷方法中灵敏度最高的方法(中华医学检验杂志，1991，14(2)：75—78)。无机磷最小定量界限为10^-9g.比经典提高2个数量级。其中WHD推荐的中等实验室测定无机磷的常规方法是比色法。决定性方法为同位素稀释质谱法。而酶法测定无机磷是发展方向。其优点是无机磷酸盐化合物在酶作用下的中性范围是稳定的，较早提的酶学方法有了—磷酸甘油醛偶联法，麦芽糖磷酸化酶与磷酸葡萄糖变位酶偶联法等。由于这些方法的敏感度较低，会影响无机磷的诊疗，进而影响他们的常规应用。以嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)和黄嘌呤氧化酶(XOD)偶联并以过氧化物酶(POD)为指标酶的方法是一种较成熟的方法。已有商品试剂盒出售，可用于常规样品的自动分析.但该方法很容易受到胆红素、尿酸及维生素等还原性物质的干扰。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计一种灵敏度更高的酶法测定磷试剂。

本发明提供了一种酶法测定磷试剂。

本发明的试剂用蔗糖磷酸化酶(SP)使蔗糖与无机磷作用形成果糖和1—磷酸葡萄糖，后者在磷酸葡萄糖变位酶(PGM)催化下形成6—磷酸葡萄糖。在6—磷酸葡萄糖脱氢酶和6—磷酸葡萄糖酸脱氢酶作用下，6—磷酸葡萄糖氧化为5—磷酸核酮糖。同时导致两分子NAD⁺被还原，通过在340nm吸光度的增加，可计算样品中无机磷的含量。

SP：蔗糖磷酸化酶

PGM：磷酸葡萄糖变位酶

G-6-PDH：6—磷酸葡萄糖脱氢酶

6PGDH：6—磷酸葡萄糖酸脱氢酶

本发明的酶法测定磷试剂由下列试剂1和试剂2组成：

试剂1：

蔗糖：50—300mmol/L

PGM：200-2500U/L

G-6-PDH：500-3000U/L

缓冲液：10—500mmol/L

NaN₃(防腐剂)：0.05％

BSA(牛血清白蛋白)：100mg/L

吐温20：1ml/L

pH7.0

试剂2：

6PGDH：500-5000U/L

NAD(氧化性辅酶I)(或NADP氧化性辅酶II)：0.5-5.0g

SP：1000U/L

Mgcl₂：30mm

吐温20：1mol/L

NaN₃：0.05％

BSA：100mg/L

缓冲液：10—500mmol/L

pH7.0

上述缓冲液可以为：