[发明专利]一种层粘连蛋白诊断试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及肝纤维化诊断技术领域，特别是一种层粘连蛋白诊断试剂盒。

背景技术

肝纤维化是人体对肝脏损伤后的一种修复瘢痕反应，是诸多慢性肝病发展至肝硬化过程中所共有的病理改变。肝纤维化形成过程受基质降解及基质积聚两方面因素制约，受细胞因子调控。肝纤维化在理论上是可逆的，采用有效抗纤维化治疗，包括消除病因，加速降解过程或诱导星状细胞凋亡，均有可能逆转病程。所以早期诊断肝纤维化并动态监测其变化对慢性肝病的治疗，改善预后有着重要的意义。

血清学诊断是目前研究最广泛的肝纤维化诊断方法。由于该法取材方便，无创伤性，价格低廉，因而较为实用。目前公认具有较高诊断价值的有III型前胶原氨基端前肽(PIIINP)，IV型胶原，层粘连蛋白(LN)，透明质酸(HA)等，报道较多。其中，层粘连蛋白(LN)属结构性糖蛋白，存在于基底膜的透明层中。研究发现其与肝纤维化形成有重要关系，是门脉高压发生的主要基础。血清层粘连蛋白水平常与IV型胶原、透明质酸等相平行，在肝纤维尤其门脉高压诊断方面有重要价值。但是，现有产品的灵敏度和特异性有待提高，特别是能达到所需血清量较少，易于操作，无放射性污染的目的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种层粘连蛋白诊断试剂盒，为临床肝纤维化的诊断和鉴别诊断提供一种灵敏度和特异性较高，所需血清量较少，易于操作，无放射性污染的手段。

为解决上述技术问题，本发明是这样实现的：

一种层粘连蛋白诊断试剂盒，其特征在于：采用双抗体夹心-ELISA法，用抗人层粘连蛋白单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的层粘连蛋白与单抗结合，加入兔抗人层粘连蛋白多抗，形成免疫复合物连接在板上，再加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体与之结合，加入酶底物OPD，出现黄色，加终止液硫酸，颜色变深，在492nm处测OD值，层粘连蛋白浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中层粘连蛋白浓度。

所述的层粘连蛋白诊断试剂盒，其特征在于：采用已包被抗人层粘连蛋白单抗96孔微孔板。

具体实施方式

本发明提供了一种层粘连蛋白诊断试剂盒，它采用双抗体夹心-ELISA法：用抗人层粘连蛋白单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的层粘连蛋白与单抗结合，加入兔抗人层粘连蛋白多抗，形成免疫复合物连接在板上，再加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体与之结合，加入酶底物OPD，出现黄色，加终止液硫酸，颜色变深，在492nm处测OD值，层粘连蛋白浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中层粘连蛋白浓度。

本发明层粘连蛋白诊断试剂盒主要由96孔微孔板(已包被抗人层粘连蛋白单抗)、样品稀释液、第一抗体工作液、酶标抗体工作液、底物稀释液、终止液、洗涤液(20x)、标准品、坐标纸、OPD片、封板纸、使用说明书组成。

使用本发明层粘连蛋白诊断试剂盒，其操作步骤是：

1.实验前20分钟从冰箱中取出试剂盒，以平衡至室温(20-25℃)。

2.取出所需数量的板条，倾去孔中液体，用洗涤液洗板1次，滤纸上拍干。剩余板条密封好，4℃保存(孔中保留保护液)。

3.建立标准曲线：设标准孔8孔，每孔中各加入稀释好的标准品100ul。

4.加样：待测品孔中每孔各加入待测样品100ul。

5.将反应板置37℃120分钟。

6.洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。

7.每孔中加入第一抗体工作液50ul。

8.将反应板充分混匀后置37℃ 60分钟。

9.洗板：同前。

10.每孔加酶标抗体工作液100ul。

11.将反应板置37℃ 60分钟。

12.洗板：同前。

13.每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗处反应5-10分钟。

14.每孔加入50ul终止液混匀。

15.在492nm处测吸光值。

结果判断：

1.所有OD值都应减除空白值后再行计算。

2.以标准品1000、500、250、125、62.5、31.25、15.63、0ng/ml之OD值在半对数纸上作图，画出标准曲线。将浓度作为X轴(对数轴)，OD值作为Y轴(线性轴)。曲线应为一光滑曲线。

3.根据样品OD值在该曲线图上查出相应人层粘连蛋白含量。