[发明专利]一种可溶性TNF受体突变体

说明书

技术领域

本发明涉及肿瘤坏死因子(TNF)受体衍生物及其在医药方面的应用。

背景技术

肿瘤坏死因子α(TNF)和淋巴毒素α(LTα)都是肿瘤坏死因子超家族的成员，具 有调节免疫反应、细胞凋亡和细胞分化等生物学活性。TNF与淋巴毒素共享两个细胞内的 受体，TNF受体1(TNFR55)和TNF受体2(TNFR75)。TNF过量表达是引起类风湿性 关节炎的重要因素，目前国际市场上治疗类风湿性关节炎最有效的主流蛋白质类药物是直 接阻断TNF生物学功能的嵌合抗体(Infliximab)和可溶性TNF？受体TNF R2:Fc融合蛋 白(Etanercept)。两种药物均表现出明显的治疗效果。

然而，Infliximab是一嵌合抗体，临床约有10％的患者会产生抗Infliximab的抗体， 使得药物清除率加快、药效下降，这在一定程度上限制了Infliximab的应用。Etanercept 能够同时与TNF和淋巴毒素高亲合度的结合，而淋巴毒素尽管在免疫调节中发挥重要作 用，但与类风湿性关节炎的发病并无关系；与淋巴毒素的结合不仅部分中和了Etanercept (商品名ENBREL)的作用，而且可能增加了严重感染的发生率。FDA网站公开的ENBREL (BLA#103795)标签信息(label information，supplement number5034，01/15/2002)报道， Etanercept在临床试验的1197例中出现了50例严重感染。因此研发选择性与TNF结合的 TNFR75，进而开发出抗体类药物TNFR75:Fc融合蛋白就显得极具价值。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种对TNFα具有选择性作用中和的可溶性受体，以克服现 有技术的不足。

本发明的另一目的是提供一种对TNFα具有选择性中和作用的可溶性受体-Fc片段融 合蛋白。

本发明的再一目的是提供对TNFα具有选择性中和作用的可溶性受体在医药方面的应 用。

本发明的构思是这样的，通过分子模拟技术对TNF受体2与TNFα和LT的结构进行 了深入的研究，发现TNF受体2天然序列的第89位氨基酸对其结合TNFα和LT非常重 要，通过合理化的设计，对第89位氨基酸进行点突变，获得具有选择性中和TNFα作用 的可溶性TNF受体2突变体。

本发明的第一方面，公开了一种可溶性TNFR75突变体，在野生型序列第89位氨基 酸进行氨基酸替换，使得与野生型相比，该突变体保持中和TNFα的细胞毒的能力，而对 LT的中和能力降低10倍以上。

在一个优选的方案中，W89突变为H、L、Y、F、R、K、M或I。即如下257个氨基 酸组成的TNFR75可溶性受体中的第89位氨基酸W分别由H、L、Y、F、R、K、M或 I替换。

TNFR75(W89L)突变体序列如下：

MAPVAVWAALAVGLELWAAAHALPAQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMCCSKCSP GQHAKVFCTKTSDTVCDSCEDSTYTQLWPECLSCGSRCSSDQVETQACTREQNRIC TCRPGWYCALSKQEGCRLCAPLRKCRPGFGVARPGTETSDVVCKPCAPGTFSNTTSSTDI CRPHQICNVVAIPGNASMDAVCTSTSPTRSMAPGAVHLPQPVSTRSQHTQPTPEPSTAPST SFLLPMGPSPPAEGSTGD

其中89位为亮氨酸(Leu)，N端1-22个氨基酸为信号肽。

本发明的第二方面，公开了一种可溶性TNFR75突变体与Fc片段融合蛋白。可溶性 TNFR75突变体与人IgG的Fc片段的232个氨基酸片段形成融合蛋白，之间不包含连接 片段。

TNFR75(W89L)：Fc突变体序列如下：