[发明专利]猪胚胎冷冻保存方法及用途

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及哺乳动物胚胎的冷冻保存。

背景技术

哺乳动物胚胎的冷冻保存开始于1972年，由Whittingham等(1972)首先发明了慢速冷冻法(常规冷冻法)，在小鼠上取得胚胎冷冻成功；1977年Willadson等对上述方法进行了改良，发明了快速冷冻法，相继在大鼠、牛、兔、山羊、绵羊等动物上获得成功，目前牛胚胎冷冻技术已达到商业化水平。但这些方法冷冻程序较繁琐、费时，而且冷冻过程中需要昂贵的程序降温仪。1985年Rall等首次发明了玻璃化冷冻方法，对小鼠8-细胞冷冻保存取得成功。此后研究者不断改进，使这项技术日趋成熟，有逐渐替代传统方法的趋势。

猪胚胎超低温冷冻对地方猪种的长期保存意义重大。长期以来，由于猪胚胎脂质含量较高等原因，进展一直较为缓慢。猪的卵母细胞和胚胎脂滴含量较高，与其他家畜(牛、羊等动物)相比对低温的耐受性较差，其研究一直处于探索阶段(Hayashi等，1989；Kashiwazki等，1991；Fujino等，1993；Dobrinsky等，1997；冯书堂等，1991；王祖昆等，1998；徐晓波等，1996)；虽然通过离心、显微操作去除脂滴后在一定程度上提高了冷冻效率，但这些方法的重复性不好(Nagashima等，1994；Hiroshi等，1998)；自Vajta等人在1997年首次报道利用开放性拉细麦管(OPS，open pulled straw)玻璃化方法冷冻猪胚胎，使胚胎解冻活率、受胎率有了较大的提高(Vajta等，1997；Berthelot等，2000；2001；Misumi等，2003)。但OPS拉制有一定的难度，当OPS管拉至0.8mm时，在狭窄处变得很脆，易于裂口；另外OPS管在液氮中容易上浮和炸裂，难于储存，成功率低，损耗严重。

因此，本领域迫切需要一种新的猪胚胎超低温冷冻承载工具，从而使运用此新的承载工具的冷冻方法，成本低，成功率高。

发明内容

本发明旨在提供一种猪胚胎超低温冷冻方法。

本发明的另一个目的是提供用上述的猪胚胎超低温冷冻方法是获得的猪胚胎，以及它的用途。

本发明的再一个目的是提供一种可用作猪胚胎超低温冷冻方法中的承载工具的玻璃管。

在本发明的第一方面，提供了一种玻璃化冷冻猪胚胎的方法，它包括步骤：

(a)在体外，对离体胚胎进行冷冻预处理，

(b)将步骤(a)获得的预处理过的胚胎与玻璃化溶液混合，获得混合物；

(c)将混合物置于冷冻胚胎承载体中，然后在液氮中冷冻保存，其中使用玻璃管作为冷冻胚胎承载体。

在另一优选例中，所述的玻璃管至少有一端的内径为0.1-1mm。

在另一优选例中，所述的玻璃管至少有一端的内径为0.2-0.8mm。更佳地为0.3-0.5mm，最佳为0.3mm。

在另一优选例中，所述的玻璃管剖面基本为圆形，至少有一端的管壁厚度0.01-0.1mm。

在另一优选例中，所述的玻璃管至少有一端的管壁厚度0.01-0.1mm。

在另一优选例中，所述的玻璃管至少有一端的管壁厚度0.01-0.06mm。

在另一优选例中，所述的玻璃管至少有一端开口。

在另一优选例中，所述的玻璃管剖面内径为0.1-1mm的一段有20-30mm。

在另一优选例中，所述的对离体胚胎进行冷冻预处理是将胚胎在渗透性防冻保护剂中放置2-6分钟，所述的渗透性防冻保护剂含有TCM199培养液、胎牛血清、乙二醇和二甲亚砜。

在另一优选例中，所述的渗透性防冻保护剂含有：40-80％TCM199培养液、10-30％胎牛血清、5-20％乙二醇和5-20％二甲亚砜。

在另一优选例中，所述的胎牛血清为新出生的牛的血清。

在另一优选例中，所述的玻璃化溶液含有TCM199培养液、胎牛血清、乙二醇、二甲亚砜和蔗糖。

在另一优选例中，所述的玻璃化溶液含有：40-80％TCM199培养液、10-30％胎牛血清、10-30％乙二醇、10-30％二甲亚砜和0.2-0.6M蔗糖。

在另一优选例中，步骤(c)中在液氮中保存2-5个月。

在另一优选例中，步骤(b)中将1-5μl含胚胎的冷冻液吸入胚胎冷冻载体中。

在另一优选例中，步骤(c)中胚胎与玻璃化溶液的混合物在10-100秒内吸入冷冻载体中。

在另一优选例中，所述的胚胎为囊胚或桑椹胚。

在另一优选例中，所述的方法还包括步骤：