[发明专利]阿霉素类抗肿瘤药物与腺相关病毒的复合制剂及其用途

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种新的基因治疗复合制剂，具体涉及阿霉素类抗肿瘤药物与腺相关病毒的复合制剂及其用途和使用方法。

背景技术

腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)，属于微小病毒科(parvoviridae)，目前已发现的AAV至少有8种血清型，AAV1-AAV8。它们的主要区别在衣壳蛋白，并因此导致各种不同血清型AAV对不同的组织和细胞感染效率不同。目前基因治疗领域普遍采用的AAV为血清型2，即AAV2。由基因工程改造产生的重组腺相关病毒称rAAV，rAAV作为基因传递载体的优越性主要有：①AAV对人体无致病性，十分安全，约80％的成年人的血清中可以检测到AAV壳蛋白的抗体，但不表现出疾病；②免疫原性低，可以反复多次使用；③宿主范围广，并能感染分裂细胞和非分裂细胞；④野生型AAV可定点整合至人的19号染色体，并能较稳定的存在，既避免了其他病毒因随机整合可能引起的抑癌基因失活和原癌基因激活的危险，又为外源基因的表达提供了较固定的染色体环境。重组后的rAAV特异性的基因组整合虽不明显，但可以环状或串联状核外附加体的形式长期存在，介导外源基因持续稳定表达；⑤AAV具有较好的热稳定性和抗酸碱性以及抗有机溶剂处理的特点，便于纯化和储存。因此，作为一种基因导入系统，AAV载体在遗传性疾病基因治疗中的应用日见增多，据不完全统计，截止2006年1月，在全世界范围内开展的基因治疗临床试验中38项(3.3％)采用重组腺相关病毒作载体(简称rAAV)，主要应用于遗传病。目前在眼底病如遗传性视网膜变性等疾病的基因治疗实验研究中也不乏使用rAAV的。

但是，AAV载体也存在某些局限性：①AAV病毒感染后，其携带的外源基因需要经过较长时间才开始表达，这是因为AAV为单链DNA病毒，进入细胞后必须转变成双链才开始表达，因此不适合用于需要治疗基因快速显效的疾病；②对细胞的感染和转导效率低，通常比腺病毒低1×10³～1×10⁴倍。通常需要按一个细胞至少1×10³～1×10⁴个AAV病毒颗粒数计算并使用，而腺病毒则只需按一个细胞10～100个病毒颗粒计算并使用。③总体上讲，治疗基因的表达水平较低。因此，实际应用中很难达到预期的治疗效果。

如何才能增加rAAV对细胞的感染和转导效率呢？已知rAAV进入细胞首先必须与细胞表面的膜受体结合。已知二类受体与rAAV进入细胞有关，一类是基础受体，如硫酸肝素蛋白多糖，另一类是共受体，如整合素αV β5。rAAV进入细胞的过程先后由基础受体和共受体介导。因此，细胞表面受体的丰度决定了rAAV的感染效率。由于细胞膜表面的受体数量较难改变，故要提高rAAV对细胞的转导效率主要拟从提高rAAV介导的治疗基因表达效率着手。

rAAV是一种单链DNA病毒，根据rAAV的生活周期，当AAV单独感染细胞时，AAV与受体结合后启动内化，然后脱去衣壳，进而被转移到核内。一部分单链病毒DNA被宿主细胞识为受损伤的DNA而被降解。另一部分单链病毒DNA通过以自身为模板进行复制形成双链，或由二条方向不同的单链病毒DNA以碱基配对的方式形成双链。只有双链DNA分子才能进一步转录表达外源基因。因此，rAAV从单链到双链的转变是限制rAAV表达的一个瓶颈。

当有辅助病毒感染时，AAV将出现产毒性感染，即发生大量病毒DNA复制，并产生新的病毒颗粒。目前已知的辅助病毒有腺病毒和疱疹病毒。辅助病毒感染可以在AAV感染之前、同时或之后进行。有研究报道腺病毒中参与提供辅助功能的基因包括E1A、E1B、E2A和E4。单疱病毒中的ICP0、ICP4、螺旋酶、引物酶复合物UL5、UL8、UL52、和DNA结合蛋白UL29参与。因此，在生产AAV及rAAV时必须同时采用腺病毒或单疱病毒联合感染，或与带有腺病毒E1A、E1B、E2A和E4辅助基因的质粒共转染。

本领域技术人员认为，由于腺病毒的免疫原性较强，可能影响rAAV携带的外源基因表达的持续时间。在基因治疗研究和临床试验中通常都是单独使用rAAV，故效果不理想。

有文献报道某些因素如紫外线照射、γ射线照射、某些化学致癌剂处理后，在某些类型的哺乳动物细胞，即使没有辅助病毒存在也可发生AAV产毒性感染。虽然这些情形下，每个细胞产生AAV病毒的量比有辅助病毒存在时低几个数量级，但这一事实提示还可以采取除辅助病毒以外的其他方法人为提高AAV的转导效率。不仅增加基因治疗的效果，也提高了基因治疗的安全性。