[发明专利]一种细胞核移植方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体地说，是关于一种细胞核移植方法。

背景技术

体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer，SCNT)技术已广泛用于克隆动物和转基因动物的生产，多种不同物种的克隆动物相继问世(Chesne P.，Adenot PG.，Viglietta C.，et al.Nat Biotechnol.2002，20：366-369；Woods GL.，White KL.，Vanderwall DK.，et al.Science2003，301：1063)。与常规的转基因动物制备方法相比，克隆技术具有独特的优势，这是由于克隆技术将筛选工作提前到了细胞水平，从而大大缩短了优种动物繁殖周期。目前，效率低下是限制该技术的瓶颈。

线粒体(mitochondrion，mt)不仅是细胞浆中含量最多的细胞器，更重要的是由于线粒体的高突变率，引起不同种群间及同一种群不同个体间线粒体DNA(mtDNA)序列的差异，表现出不同的单倍型，这种差异可引起生物性状的不同，例如在奶牛中可引起产奶量及生育能力的差异(Tamassia M.，Heyman Y.，Lavergne Y.，et al.Reproduction 2003，126：629-637；Sutrno，Cummins JM.，Greeff J.，et al.Theriogenology 2002，57：1603-1610；MannenH.，Kojima T.，Oyama K.，et al.J.Anim.Sci.1998，76：36-41)。

最近几年，动物繁殖领域中卵母细胞线粒体单倍型日益成为研究热点。传统的单倍型概念是指使用特定限制性内切酶酶切特定片段后产生的特定酶切片段格局。来自体外胚胎生产(IVP)和体细胞核移植的研究均说明体外胚胎的发育明显受母本mtDNA单倍型影响，并且伴有卵母细胞ATP及mtDNA拷贝数的差异(Tamassia M.，Nuttinck F.，Reynier P.，et al.Biol.Reprod.2004，71：697-704；Bruggerhoff K.，Zakhartchenko V.，Wenigerkind H.，et al.Biol.Reprod.2002，66：367-373；Hiendleder S.，Prelle K.，Bruggerhoff K.，et al.Biol.Reprod.2004，70：1196-1205)。

本申请人在其申请号为200410016219.7的中国发明专利申请中公开了一种同体细胞核移植方法，该方法是取同一个体的供核体细胞与去核卵母细胞进行细胞核移植，结果显示克隆囊胚在数量和质量上均有显著提高。发明人由此联想到，目前由常规核移植方法(异体核移植)得到的胚胎，由于含有不同的受体和供体mtDNA单倍型，这些单倍型可能影响重构胚的发育能力。发明人在前期的研究中发现，某些类型的卵母细胞有利于克隆胚胎的发育，可能与胞质中某些mtDNA单倍型更适合胚胎发育有关，其中核编码因子与某些mtDNA单倍型相兼容可能发挥了重要作用，从而有利于特定线粒体类型的克隆胚胎的成活。

发明内容

为了验证上述推测，发明人通过PCR-RFLP技术对实验动物的线粒体DNA进行单倍型分析，将不同实验动物的线粒体DNA单倍型分为4种类型，然后利用单倍型相同的供核体细胞和受体卵母细胞进行核移植，结果发现采用单倍型相同的细胞核移植能够有效提高重构胚的发育能力。

因此，本发明的目的就在于提供一种细胞核移植方法，该方法选取线粒体DNA单倍型相同的非人哺乳动物的供核体细胞和受体卵母细胞进行核移植。

具体地，本发明的细胞核移植方法包括以下步骤：

a、选取某一线粒体DNA单倍型的非人哺乳动物，以其成皮肤成纤维细胞或卵丘细胞作为供核体细胞；

b、选取线粒体DNA单倍型相同的同一种哺乳动物，以其卵母细胞作为受体细胞；

c、受体卵母细胞去核；

d、将供核体细胞的细胞核移入去核卵母细胞的细胞质中，使细胞核融入卵母细胞，形成重构胚。

本发明的同型(线粒体DNA单倍型相同)细胞核移植方法能够有效提高重构胚的融合率、卵裂率以及囊胚率，相比异型(线粒体DNA单倍型不同)核移植，囊胚率提高了约1.5倍。