[发明专利]可拮抗血管内皮细胞生长因子的人源化的免疫球蛋白的制备方法及其组合应用

权利要求书

1.六种可特异识别与结合血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的人源化的融合免疫球蛋白。该六种免疫球蛋白的共同特征是其N-端含有数个可结合VEGF的免疫球蛋白样结构区，而其C-端含有人免疫球蛋白恒定区。该类免疫球蛋白保留有与VEGF高度结合的生物活性及免疫球蛋白的双重活性。这六种融合免疫球蛋白的代号及名称分别为：

  融合蛋白的代号    融合蛋白的名称    1.PF1    2.PF2    3.PK1    4.PK2    5.PF1K1    6.PF2K2    Flt1 D123-IgM    Flt1-D123-IgG    KDR-D123-IgM，    KDR-D123-IgG    Flt1-D123-IgM/KDR-D123-IgM    Flt1-D123-IgG/KDR-D123-IgG

其中的免疫球蛋白PF1(Flt1-D123-IgM)和PF2(Flt1-D123-IgG)的N-端含VEGF受体Flt-1的胞膜外结构区中的第1，第2及第3免疫球蛋白样胞结构区(即Flt1-D123)；而免疫球蛋白PK1(KDR-D123-IgM)和PK2(KDR-D123-IgG)的N-端含VEGF受体KDR的胞膜外结构区中的第1，第2及第3结构区(即KDR-D123)。而免疫球蛋白PF1K1(Flt1-D123-IgM/KDR-D123-IgM)为PF1(Flt1-D123-IgM)与PK1(KDR-D123-IgM)相结合的异源二倍体；免疫球蛋白PF2K2(Flt1-D123-IgG/KDR-D123-IgG)为PF2(Flt1-D123-IgG)与PK2(KDR-D123-IgG)相结合的异源二倍体。

2.一种制备权利要求1的六种免疫球蛋白的方法，其步骤包括：a)以多聚酶链式反应(PCR)及重组基因工程方法构建含有Flt-1或KDR胞膜外结构区D123与人免疫球蛋白恒定区(IgM或IgG的Fc-段基因)相连的重组基因的表达载体；  该类表达载体的特征在于其具有如基因序列表1至表3所示的重组基因核苷酸序列；b)表达载体转染入哺乳动物细胞及鉴定、检测重组免疫球蛋白在转染细胞中的分泌性表达；c)重组免疫球蛋白表达阳性细胞的筛选、扩增培养及上清液的收集；d)以免疫亲和层析柱法从收集的细胞培养上清液中分离提取重组免疫球蛋白。

3.用权利要求1的重组免疫球蛋白为试剂盒成分进行体内或体外检测VEGF表达水平的方法；其特征在于被检测的VEGF是以流离降级的可溶性物质形式存在于体液(如血清、血浆、唾液等)与细胞培养上清液中或以膜蛋白形式表达于细胞/组织中。

4.用权利要求1所述的重组免疫球蛋白为吸附剂，体内外分离或清除VEGF及VEGF表达阳性细胞或组织的方法。

5.权利要求1所述的每种免疫球蛋白作为VEGF的中和吸附剂，单个独立使用以中和吸附体内外VEGF。权利要求1所述的几种免疫球蛋白按其中和吸附VEGF作用的效果大小由高到低排序为：Flt1-D123-IgM＞KDR-D123-IgM＞Flt1-D123-IgG＞KDR-D123-IgG

6.将权利要求1所述的各种免疫球蛋白组合在一起使用，以达到更彻底地中和吸附VEGF及拮抗抑制VEGF介导的血管新生的药用方法。