[发明专利]重组人角质细胞生长因子－2生物活性测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，更具体地，本发明提供了重组人角质细胞生长因子-2的一种生物活性测定方法。

背景技术

重组人角质细胞因子-2(Recombinant Human Keratinocyte Growth Factor 2，rhKGF-2)是角质细胞特异性的增殖因子，可以用角质细胞作为活性检定细胞。但是角质细胞在传代两代后就不能再进行活性检测，需要原代培养，并且国外文献报道，在进行KGF-2活性检测时，使用〖H³〗作标记，获得检测结果，进行分析，这样，检测仪器要求和放射性物质的善后工作非常复杂和繁琐，不适合作为生产中批产品的常规活性检测方法。我们曾经购买的Clonetics公司的NHEK细胞(角质细胞)做为检测细胞，但由于细胞难培养，死亡率高，极不稳定，没有成功。国外对KGF-2活性检测使用的细胞株(BaF3细胞)是转染KGF-2受体后进行检测，然而该细胞株没有商品化，无法市购。

国外文献报道在较高浓度下(100ng/ml)rhKGF-2对成纤维细胞有增殖作用(Characterization of Recombinant Human Fibroblast Growth Factor(FGF)-10 RevealsFunctional Similarities with Keratinocyte Growth Factor(FGF-7)，J Biol Chem，Vol.273，Issue 21，13230-13235，May 22，1998)。

国内亦有文献报道使用NIH/3T3细胞作为检测细胞株，使用10μg/ml浓度下与2.5ng·mL^-1的bFGF进行增殖对照，使用20mmol·L^-1的磷酸盐缓冲溶液(PBS)做阴性对照，结果发现实验组和阳性对照组细胞数明显多于阴性对照，表明rhKGF-2能明显促进NIH/3T3细胞的分裂和生长(马雁冰，李擎，谢天宏，等.重组人角质细胞生长因子-2基因克隆、表达、纯化与活性分析[J].中国生物化学与分子生物学报，2001，17(6):761-765.)。另外NIH3T3细胞株是常见细胞株，易培养，传代次数不受限值，是常规活性检测用的理想细胞株。同时结合bFGF和EGF的活性检测方法，我们建立了KGF-2的生物活性检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种新颖的，准确性高，方便实用、成本低廉的重组人角质细胞生长因子-2生物活性的测定方法。

本发明采用成纤维细胞NIH3T3作为测活细胞株，通过改良细胞培养方法：控制包括细胞接种密度、细胞饥饿时问、样品加入方法，并采用MTT法进行检测，最后在570nm处进行比色，采用吸光值测定rhKGF-2对NIH3T3细胞的促增殖和分裂作用。

本发明人采用的KGF-2活性检测方法，实验用细胞数在6000-8000/孔，自制标准品的反应浓度范围在10⁴-78ng/ml，并且2倍梯度进行稀释，在饥饿这一步本发明人选择含有1％胎牛血清浓度的培养液，稀释液也为含有1％胎牛血清浓度的培养液，样品的反应时间为60-72小时之间。在确定方法的同时，我们对其进行了方法验证，以确定它的准确度、精确度等相关因素。

附图说明

无。

具体实施方式

一、NIH3T3细胞的培养

试剂要求：

1.基础培养基：