[发明专利]一种重组人生长激素(rhGH)高效表达方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，更具体地，本发明提供了一种高密度、高效的重组人生长激素表达工艺。

背景技术

人生长激素(hGH)是人内源性激素，由人脑垂体前叶合成分泌，在人体生长发育方面起着极其重要的作用。成年人血浆hGH水平为1-5ng/ml，半衰期为15-20分钟。

基因工程表达rhGH始于1979年，Goeddel等人将hGH基因置于乳糖操纵子的调控下，在大肠杆菌系统中表达获得2.4mg/L的产量。Gray和他的同事在1985年实现了人rhGH的分泌性表达(rhGH基因接上大肠杆菌碱性磷酸酶的信号肽序列)-分泌到大肠杆菌的周质空间，但产量太低；此后，Becker和Chang等人分别利用不同的信号肽序列将hGH的分泌表达水平(分泌到周质空间)提高到大约15mg/L。1987年，Kato等人将hGH基因和细菌的杀手基因(kill gene)藕联，获得hGH的分泌表达水平达到20.5mg/L，其中直接分泌到培养基中的水平达11.2mg/L，滞留在周质空间的约8.6mg/L。目前，上市的rhGH均用大肠杆菌表达系统生产，此生产工艺rhGH得率较低，有待提高。

1997年，Olazaran等人首次采用毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统表达rhGH并获得了成功。但是Olazaran等人获得的毕赤酵母表达rhGH的表达水平偏低，经优化后表达水平也只有13mg/L，而且实现产业化成本较高。

我们应用毕赤酵母表达系统生产重组人生长激素(rhGH)：首先全基因合成rhGH的基因序列，将其克隆到载体质粒pPIC9K中，随后转化毕赤酵母株GS115，通过G418筛选高拷贝转化子，然后通过筛选获得高表达工程株，并对获得的工程菌进行生理生化特征鉴定和外源基因拷贝数测定。建立主种子库，并进行了传代稳定性实验。通过经典的方法，发现HGH能够有一定的表达，但表达水平较低，说明此项目的发酵工艺还需要进行不断地摸索，优化发酵工艺路线，提高表达水平。

本发明提供了一种重组人生长激素的新型发酵方法，采用毕赤酵母表达体系分泌表达，通过优化发酵工艺，整个过程稳定、快速、简便，获得高密度、高表达水平的重组人生长激素。本发明为重组人生长激素的进一步产业化研究奠定了基础。

发明内容

本发明的目的就是提供一种高密度的重组人生长激素(rhGH)的表达方案。包括用于该方案的培养基及诱导条件。

在本发明的第一方面，就是提供了一种新型重组人生长激素(rhGH)的氨基酸序列，其特征在于，其序列为A-B，其中A为r-hGH第1-26位信号肽氨基酸；B为r-hGH第27-217位为非糖基化氨基酸，去掉了A区信号肽序列。

在本发明的第二方面，提供了一种工程菌，其特征在于，它整合有编码上述新型重组人生长激素(rhGH)的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的工程菌是毕赤酵母。

在本发明的第三方面，提供了一种重组人生长激素的中试生产方法，该方法包括步骤：

a)在适合的表达条件下，在摇瓶中培养宿主细胞，从而分泌表达出新型重组人生长激素；

b)在适合的表达条件下，在5L发酵罐中优化出最佳中试生产方案。

附图说明

表1表达培养基的选择。

图1不同培养基诱导目的蛋白r-hGH表达的电泳图。6：蛋白分子量标准(从上到下分子量为97.4KD、66.2KD、43.0KD、31.0KD、20.1KD、14.4KD)2～13分别与表1中的1～12号培养基对应。

图2摇瓶不同pH表达电泳图。4：蛋白分产量标准(从上到下分子量为97.4KD、66.2KD、43.0KD、31.0KD、20.1KD、14.4KD)1：诱导前摇瓶上清液2、3、5、6、7：依次为pH3～7条件下诱导24hr摇瓶上清液8、9、10：依次为pH3～5条件下诱导48hr摇瓶上清液。

图3摇瓶补料优化电泳图。1：诱导前对照3：蛋白分子量标准(从上到下分子量为97.4KD、66.2KD、43.0KD、31.0KD、20.1KD、14.4KD)2、4～10：依次为添加CA、Yeast extract、peptone诱导48hr摇瓶上清液11、12：为空白诱导48h上清。

图4不同诱导温度表达HGH电泳图。1：蛋白分子量标准(从上到下分子量为97.4KD、66.2KD、43.0KD、31.0KD、20.1KD、14.4KD)。2、3：25℃；4、5：37℃；6、7：30℃