[发明专利]重组人角质细胞生长因子－2的高密度发酵方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，更具体地，本发明提供了一种高密度、高效的重组人rhKGF-2表达工艺。

背景技术

KGF-2是一个崭新的具有治疗性应用潜能的蛋白，可用于治疗皮肤损伤和粘膜组织损伤，包括外伤性创口、慢性创伤、粘膜炎、炎性肠病等。

本发明人在前期分子生物学构建基础上，筛选并鉴定出高表达菌株BL21(DE3)/p ET30a(+) /KGF-2，并以此菌株为基础建立了此工程菌的三级种子库，以此为菌种经过发酵、纯化，获得rhKGF-2原液，用于制剂。

通过对整个rhKGF-2的发酵工艺分别在摇瓶水平、发酵罐水平进行了系统化的研究，内容涉及：培养基种类、诱导剂浓度、诱导温度、pH、诱导菌密度、诱导时间以及不同补料策略等，不断地优化工艺，确定采用高密度发酵方法，每升培液可收获菌体25g以上，rhKGF-2的表达量达800mg/L培液。该工艺经过连续三批中试规模(5L体积)及连续二批放大规模(300L体积)的生产，证实工艺稳定，具备产业化价值。

以阳性克隆建立原始种子库，该种子库的检测表明无外源因子污染，各项生化指标达到要求，表达水平达到要求。本发明提供了一种重组人rhKGF-2的新型发酵方法，采用大肠杆菌表达体系以包涵体表达，通过优化发酵工艺，整个过程稳定、快速、简便，获得高密度、高表达水平的重组人rhKGF-2。

发明内容

本发明的目的就是提供一种高密度的重组人rhKGF-2的表达方案。包括用于该方案的培养基及诱导条件。

在本发明的第一方面，提供了一种重组人rhKGF-2的中试生产方法，该方法包括步骤：

a)在适合的表达条件下，在摇瓶中培养合适的宿主细胞，从而以包涵体形式表达出重组人rhKGF-2；

b)在适合的表达条件下，在5L和300L发酵罐中优化出最佳中试生产方案。

在本发明的二方面，提供了一种工程菌，其特征在于，它含有编码人rhKGF-2的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的工程菌是大肠杆菌。

本发明的优点在于：

(1)此方案具有高稳定表达的特点。对此高密度高效表达方法进行了发酵工艺稳定验证，证实该工艺稳定性好。

(2)通过控制关键的发酵工艺条件，使表达水平较高。

(3)发酵工艺简便，产率高。

附图说明

图1中试发酵最佳培养基摸索电泳图。1：Marker 2：诱导前；3～6：M9培养基(诱导1，2，3，4hr)；7～9：M9-4培养基(诱导3，2，1hr)。

图2中试发酵不同诱导时间的SDS-PAGE电泳。1：Marker；2，3：诱导2hr；4，5：诱导3hr；6，7：诱导4hr；8，9：诱导5hr；10：诱导前。

图3中试发酵不同诱导OD₆₀₀对表达水平(％)的曲线。

表1在5L发酵罐上进行补料的搭配选择。

图4中试发酵不同补料(见表1)对表达影响的SDS-PAGE电泳。M：Marker；1-3：1-3号罐诱导前；4-6：1-3号罐诱导1hr；7-9；1-3号罐诱导2hr；10-12：1-3号罐诱导3hr。

图5中试条件优化的SDS-PAGE电泳。1：Marker；2：诱导前；3：诱导3hr。

图6高密度发酵SDS-PAGE电泳图。1：Marker；2、5：1号和2号罐的诱导前；3、4：1号罐诱导2、3hr；6、7：2号罐诱导2、3hr。

图7中试连续五批发酵研究(6.5L发酵罐)的表达SDS-PAGE 图。1：Marker；2，6：诱导前；3，4，5，7，8：连续5批表达结果(诱导3hr)。

图8在3001发酵罐上连续二批发酵的SDS-PAGE电泳图。1：Marker；2：诱导前；3～4：连续二批表达结果(诱导3hr)。

表2连续5批高密度发酵数据(NBS 5L和300L发酵罐)。

图9摇瓶不同培养基对表达水平的影响曲线。

图10摇瓶不同IPTG浓度诱导目的蛋白表达的电泳图。1：Marker；2～9：IPTG浓度为：0.1-0.8mM；10：诱导前；11～14：IPTG浓度为：0.9-1.2mM。

图11摇瓶不同温度对KGF-2表达影响的电泳图。1：Marker；2、3：30℃诱导3hr；4、5：35℃诱导3hr；6、7：40℃诱导3hr。

图12摇瓶不同pH对表达影响的电泳图。1：Marker；2～11：诱导pH6.0-7.8(每0.2/点)。