[发明专利]一种莽草酸生产菌株及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，是关于一种莽草酸生产菌株及其构建方法。

背景技术

莽草酸(Shikimic acid)是合成生物体内新陈代谢化合物的中间体，也是合成许多生物碱、芳香氨基酸与吲哚衍生物、手性药物(如抗病毒药)的原料。莽草酸的分子结构中有三个羟基、一个羧基、一个双键，具有手性异构体，它可以成酯，也可以成盐。莽草酸化学名称为3，4，5-三羟基-1-环己烯-1-羧酸，其结构式如下：

达菲(Tamiflu)目前认为是抗H5N1型高致病性禽流感病毒的最有效药物，而莽草酸正是生产达菲的上游关键原料。

目前，莽草酸主要由中国广西生长的中药八角的种子萃取提纯而来。八角含有多种化合物，有的对人体有害。多食八角非但不能医治禽流感，反而会引起身体不适。从八角提取的莽草酸，再经过十几步反应得到的Tamiflu(达菲)才是抗禽流感病毒药。瑞士罗氏制药公司拥有Tamiflu(达菲)生产的专利权，价格非常昂贵。

虽然罗氏公司和日本味之素已经发展出以生物工程手段生产莽草酸的方法，但从提纯、生物活性及成本角度考虑，“达菲”的生产依然主要依赖中国广西八角。目前，莽草酸和八角都已经短缺，价格上涨好几倍，莽草酸每公斤在200～250美元之间，质量特别好的，价格高达每克50美元。

因此，利用葡萄糖甚至更廉价的可再生资源，通过微生物来发酵生产莽草酸，从而开辟新的原料制备途径，是业内所追求的目标。微生物繁殖快、代谢能力强，通过利用其莽草酸代谢途径进行改造，可获得目标产物莽草酸的有效积累，解决达菲制备原料不足的瓶颈。国外一些公司已开展相关研究，但实现产业化还需进一步优化条件。

发明内容

本发明的目的就在于通过基因工程的方法对大肠杆菌的莽草酸合成途径进行改造，从而提供一种莽草酸的生产菌株。

本发明的另一个目的在于提供所述莽草酸生产菌株的构建方法。

本发明的莽草酸生产菌株的构建方法包括以下步骤：

A、构建aroL和aroK双基因敲除的菌株W3110(ΔaroL ΔaroK)；

B、构建含有莽草酸代谢途径中的关键基因aroF、aroE、aroB、ppsa以及tktA基因的重组表达质粒pSUFEBPT；

C、将重组表达质粒pSUFEBPT转入双敲除菌株W3110(ΔaroL ΔaroK)获得表达莽草酸的生产菌株。

本发明所构建的莽草酸生产菌株W3110(ΔaroL ΔaroK)已于2006年9月4日提交位于武汉的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCC M 206083。

利用本发明所获得的基因工程菌株CCTCC M 206083进行发酵，可以获得目的产物莽草酸的有效积累，从而为莽草酸生产的产业化奠定了基础。

附图说明

图1为单敲除菌株BW25113(ΔaroK)的PCR鉴定结果示意图，显示aroK基因已经被敲除；其中泳道1：野生型BW25113菌株PCR产物(1.3kb)；泳道2-5：ΔaroK-773/BW25113突变株PCR产物(2.1kb)；泳道6：DNA marker。

图2为单敲除菌株BW25113(ΔaroL)的PCR鉴定结果示意图，显示aroL基因已经被敲除；其中泳道1：DNA marker；泳道2-4：ΔaroL-778/BW25113突变株；泳道5：野生型BW25113菌株。

图3为双敲除菌株BW25113(ΔaroLΔaroK)以引物aroL-up和aroL-down进行PCR鉴定的结果示意图，显示aroL基因已经被敲除；其中泳道1：野生型BW25113菌株；泳道2-3：ΔaroL-778/BW25113突变株；泳道4：DNA marker。

图4为双敲除菌株BW25113(ΔaroLΔaroK)以引物aroK-up和aroK-down进行PCR鉴定的结果示意图，显示aroK基因已经被敲除；其中泳道1：DNA marker；泳道2：野生型BW25113菌株；泳道3-6：ΔaroK-773/BW25113突变株。