[发明专利]一种分离纯化嗜铁钩端螺旋菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种微生物培养方法，特别是一种嗜铁钩端螺旋菌(Leptospirillum ferriphilium)纯培养物的分离方法。

背景技术

嗜铁钩端螺旋菌(Leptospirillum ferriphilium)是一类专性化能自养铁氧化细菌，革兰氏阴性，最适生长pH 2.5，最适生长温度40℃，能够直接氧化硫化矿物，在微生物浸矿过程中具有重要作用。该菌种不易于纯培养，在普通琼脂固体培养基平板上很难形成菌落，目前它的分离纯化主要是采用琼脂糖双层平板培养基方法，D.B.Johnson及刘缨，刘相梅，田克立在《微生物学通报》，2003，30(6)，“氧化亚铁钩端螺旋菌在固体平板上的培养及形态观察”中所记载的方法.他们利用琼脂糖作固化剂，在底层平板中加入嗜酸性异养细菌(Heterotroph Acidiphilium SJH)消耗上层无磷培养基中琼脂糖的一些寡糖类物质而促进嗜铁钩端螺旋菌菌落的形成。该方法显示，菌落形成时间较短，得率较高，但是，该方法使用双层平板，步骤较单层平板要复杂，使用琼脂糖作凝胶剂其价格比琼脂高出约10倍，另外需要嗜酸性异养细菌(Heterotroph Acidiphilium SJH)作为辅助细菌，增加了分离工作的额外工作量以及引进了新的影响因素。

发明内容

本发明提供了一种用单层平板分离方法得到纯的嗜铁钩端螺旋菌的方法，采用改良的固体培养基成分以及优化的培养条件实现分离，它较双层平板分离方法简便很多，用普通琼脂作凝胶剂降低费用，且不需要添加任何其它细菌辅助分离，能大大地减少工作量，并且菌落形成率较高，形成菌落时间在两周左右。

本发明将采集的酸性矿坑水样品用9K无机盐液培养基富集培养一代，然后将其传代用一种新的选择性液体培养基A-M培养，选择性液体培养基A-M成分为：(NH₄)₂SO₄3g/L，KCl0.1g/L，K₂HPO₄0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，Ca(NO₃)0.01g/L，MnSO₄ 1.0g/L，Al₂(SO₄)₃·18H₂O 2.1g/L，FeSO₄·7H₂O44.5-60.0g/L设定培养基pH值为1.5-1.7，并设定其培养温度为38-42℃，传代培养3～4次且每次稀释5-10倍传代，最后将处于对数生长期培养物取适量稀释20-100倍，取其中100μL在改良的单层固体培养基上均匀涂布。改良的单层固体培养基配方由A，B和C三部分组成：A成分同于上述选择性液体培养基A-M成分：(NH₄)₂SO₄3g/L，KCl0.1g/L，K₂HPO₄0.5g/L，MgSO₄·7H₂O0.5g/L，Ca(NO₃)0.01g/L，MnSO₄1.0g/L，Al₂(SO₄)₃·18H₂O₂.1g/L，溶于400mL蒸馏水；B：普通琼脂10-15g溶于300mL蒸馏水；C：FeSO₄·7H₂O 44.5-60.0g/L，KSCN 15.5-25.0g/L溶于300mL蒸馏水。将A和B部分分开高压蒸汽灭菌116-121℃，20-30mins，最后将A，B和C三部分混合，调pH值2.0-3.5，倒平板，在平板上均匀涂布菌液。涂有菌液的固体培养基平板先正置5～10分钟，待菌液吸收后倒置于36-45℃恒温培养箱培养。固体培养基颜色为红褐色，两周左右长出十多个大小不一的黄色光滑菌落，大的菌落直径可达3mm左右。

本发明只要用单层平板就能分离得到纯的嗜铁钩端螺旋菌，采用普通琼脂作凝胶剂，不需要添加任何其它细菌辅助分离，菌落形成率较高，较双层平板方法更简单易行。

具体实施方式：