[发明专利]香蕉枯萎病菌4号生理小种的检测引物及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一个植物病原真菌的检测引物及其检测方法。

背景技术

香蕉镰刀菌枯萎病又称香蕉巴拿马病、黄叶病，是由镰刀菌侵染引起维管束坏死的土传性病害，病原菌为尖镰孢霉古巴专化型[Fusarium oxysporum f.sp.cubense(E.F.Smith)Snyder etHansen](FOC)。病原菌从受伤的根茎侵入，通过寄主维管束向茎上发展，并进一步向假叶部蔓延。当植株枯死后，病原菌随残体遗留在土壤中，随着水流或带菌的农具在蕉园内再进行自然传播，其厚垣孢子可在土壤中存活8-10年。由于该菌存活期长，传播迅速，尚未有防止该病的特效药物，因此一旦在香蕉产地发病，很可能大面积爆发将造成重大损失。

尖镰刀菌古巴专化型有4个生理小种，1号小种(racel)感染香蕉的栽培种“大蜜哈”[Grosmichel(AAA)]及龙牙蕉(MusaAAB)，矮蕉[Dwarfcavendish(AAA)]较抗病，该小种呈世界分布，在中国大陆已有记录；2号小种(race2)在中美洲，仅感染三倍体杂种梭香蕉[Bluggoe(AAB)]，不侵染“大蜜哈”；3号小种(race3)感染野生的羯尾蕉属(Heliconia)；4号小种(race4)能感染几乎所有的香蕉种类，如Cevendish、“大蜜哈”、矮香蕉、野蕉(BB)和梭指蕉，毁灭性最大，在全世界范围内尚末找到有效的抵抗4号小种的香蕉品种。

香蕉枯萎病对目前世界香蕉生产已造成重大威胁，因而，如何控制该病原菌的进一步蔓延成为目前防控香蕉枯萎病的关键。

发明内容

本发明的目的是针对现有防控香蕉枯萎病的不足，提供一种香蕉枯萎病菌4号生理小种快速检测引物。

本发明的另一个目的是提供利用上述引物检测香蕉枯萎病菌4号生理小种的方法。

本发明的香蕉枯萎病菌4号生理小种的检测引物RF4，其核苷酸序列如下所示：

RF4-1：5’-TGCGGGTCCTATTAGTAC-3’

RF4-2：5’-GGTCCTCACACTCCAATC-3’。

利用上述检测引物RF4检测香蕉枯萎病菌4号生理小种的方法，包括如下步骤：设计引物RF4浓度、模板DNA、dNTPs、TaqDNA聚合酶及PCR退火温度梯度，然后进行PCR反应，反应结束后，取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

上述检测方法所述PCR反应各组分和最佳用量为：

模板DNA           1体积

10×PCR Buffer    2.5体积

Mg²⁺  25mmol/l    2.5体积

DNTPs 25mM    2体积

引物RF4-1     1体积

引物RF4-2     1体积

Taq酶5U/μL   0.2体积

灭菌ddH₂O     14.8体积；

所述PCR反应程序为：94℃4min；94℃30s，52℃30s，72℃45s，重复35个循环；72℃10min。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明采用特异引物RF4并优化反应条件，建立了香蕉枯萎病菌4号生理小种的PCR检测方法，该方法能够特异、灵敏、有效的检测香蕉枯萎病菌4号生理小种。利用该方法能够检测到相当于0.1μg的菌丝，并且从香蕉的根和茎中均能够检测到病原物。

附图说明

图1为引物RF4扩增的FOC4的核酸序列(R1-F4)图；

图2为PCR检测的灵敏度结果图；

图3为PCR检测纯病菌结果图；

图4为PCR检测香蕉不同组织结果图；

图5为PCR检测采集于番禺的样品结果图；

图6为PCR检测采集于中山的样品结果图；

图7为PCR检测采集于江门、高州的样品结果图；

图8为PCR检测采集于番禺、中山和江门的吸芽结果图；