[发明专利]检测结核分枝杆菌及其耐药基因突变的方法和试剂盒

说明书

所属领域

本发明涉及检测临床生物样品中结核分枝杆菌及其耐药基因突变的方法及试剂盒，特别是涉及以反向斑点杂交技术快速检测临床痰液、血液、支气管灌洗液、腹水及脑脊液等生物样品中结核分枝杆菌菌的存在及其耐药基因突变的方法和所使用的试剂盒。

发明背景

结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)导致的一种传染性疾病。据世界卫生组织估计，目前全球约有20亿人感染结核分枝杆菌，每年死于结核的约有300万[Raviglione M C，et al.Global epidemiology of tuberculosis.Morbidity and mortality of a worldwide epidemic.JAMA，1995，273：220-226.]。近年来，由于流动人口的增加和艾滋病发病率的升高，全球结核病发病率大幅度上升。尤其是结核分枝杆菌对抗结核药物的耐药性更加剧了结核病在大范围内的流行和传播。耐药结核杆菌尤其是多药耐药结核杆菌(Multi drug-resi stantMycobacterium tuberculosis，MDR-TB)传播速度快，患者病情进展迅速，死亡率高，有些病例从诊断到死亡仅为4～6周。在一般临床实验室中，结核分枝杆菌药物敏感性检测仍采用传统的方法，如绝对浓度法、比例法和抗性比率法，由于结核杆菌生长缓慢，在得到分离培养物后仍需1～2个月才能获得结果，因此，依赖传统的细菌培养和药敏实验会延误宝贵的治疗时间。尽管近年来发展起来的BACTEC TM MGITTM960系统能缩短结核杆菌培养和药敏实验的周期，但仍需要一周左右的时间。而且，其仪器设备和试剂相当昂贵，所以仅能在极少数的医院开展。众多研究表明，快速核酸检测结核杆菌病原体比传统的痰涂片和结核杆菌培养检测要更灵敏、更有利于临床早期诊断。目前核酸检测如荧光定量PCR技术检测结核分枝杆菌已广泛应用于临床实验室，此外，核酸检测也已大量用于结核杆菌的耐药性分析。异烟肼和利福平是临床最常用的治疗药物，有作者报告约90％的结核分枝杆菌耐利福平同时也对异烟肼耐药，因而，对结核杆菌进行利福平和异烟肼耐药性分析可作为耐多药结核杆菌的筛选指标[Ramaswamy S，Musser JM.Molecular genetic basis of antimicrobial agent resistance in Mycobacteriumtuberculosis：1998update.Tuberc Lung Dis，1998，79：3-91.]。

研究表明，结核杆菌重要代谢酶基因或抗菌药物作用靶点的突变是导致抗痨药耐药的主要分子机制。rpoB基因含有3534bp的开放读码框，编码1178个氨基酸。rpoB基因内少数密码子突变引起编码RNA聚合酶β亚基构象发生改变，失去结合利福平的能力，而导致细菌耐药的发生。统计资料表明，在结核分枝杆菌耐利福平分离株中，近95％菌株能检出rpoB基因突变[Pozzi G，Meloni M，Zona E，et al.rpoB mutation in multidrug-resistant strains of Mycobacteriumtuberculosis isolated in Italy.J Clin Microbiol，1999，37：1197-1199.]。rpoB基因突变一般发生在该基因内一个高度保守的81bp区域内(507-533位27个氨基酸密码子)。其中最常见的突变位点为531位丝氨酸(Ser)→亮氨酸(Leu)，526位组氨酸(His)→酪氨酸(Tyr)、天门冬氨酸(Asp)，516位天门冬氨酸(Asp)→缬氨酸(Val)，此外，常见的点突变还有513位，511位等。研究表明，结核杆菌对异烟肼耐药性产生主要与过氧化氢酶—过氧化物酶基因KatG以及烯酰基还原酶基因inhA启动子区域的突变有关。katG基因最常见的点突变为315位丝氨酸(AGC)→苏氨酸(ACC)，inhA基因启动子区域最常见突变为inhA-15位(C-T)突变。据文献报道，近60-80％的耐异烟肼结核分枝杆菌分离株均能检测出katG基因和/或inhA基因启动子区域突变。katG和inhA启动子区基因突变是结核杆菌耐异烟肼的主要分子机制。