[发明专利]检测乙型肝炎病毒cccDNA的巢式－实时定量PCR方法

说明书

技术领域

本发明涉及乙型肝炎病毒的测定方法，尤其涉及乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA(cccDNA)的巢式-定量PCR检测方法。

背景技术

乙型肝炎病毒(HBV)严重危害人类的生命健康。它侵入肝细胞后，在胞质中脱去核壳，形成松驰环状DNA(rcDNA)，其两条链均不是闭合的。rcDNA进入肝细胞核中，依赖宿主细胞的DNA聚合酶补齐两条链上的缺口，进一步折叠、扭曲形成超螺旋结构的cccDNA，并以之为模板转录成大小不同的mRNA，再翻译成各种病毒蛋白。其中3.5Kb的mRNA作为逆转录模板，利用病毒的逆转录酶合成全长的基因组负链DNA，再以负链DNA作为模板，通过病毒DNA聚合酶的作用，合成正链DNA，与负链DNA一起组成新的HBV rcDNA。新合成的HBV rcDNA一方面进入细胞核内，转化为新的cccDNA，补充细胞内的cccDNA库，使每个肝细胞中保持大约5～50个cccDNA分子；另一方面与病毒蛋白装配成新的完整的HBV，释放至细胞外，再感染健康的肝细胞。cccDNA与rcDNA在结构、理化特性等方面的差异见表1。

表1  cccDNA与rcDNA结构、理化特性的差异比较

    cccDNA    rcDNA    核酸一级结构    完整的双链    两条链均不完整    核酸空间结构    闭合环状，超螺旋    松弛环状，非超螺旋    碱变性的影响    可以再复性    不能再复性    与蛋白质结合能力    不能共价结合    能共价结合    对核酸酶抗性    强，不容易被降解    弱，容易被降解

目前应用的抗HBV药物仅对HBV rcDNA有抑制作用，但不能阻断cccDNA的形成。因此，只要肝细胞中还存在cccDNA，HBV就会继续复制，致使停药后患者的病情经常反复发作。可见，正确测定乙肝患者cccDNA的水平，对于判断乙肝患者病毒携带状态、确定抗病毒疗程及停药时间等有重要的临床意义。根据cccDNA与rcDNA在结构和理化特性上的不同(表1)，国内外学者尝试建立了多种cccDNA的检测方法：