[发明专利]表达嗜热毛壳菌gla基因的酵母工程菌株及其构建方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及生物工程，具体地说是一种表达热稳定外切糖化酶基因gla的酵母基因工程菌株及其构建方法。

(二)背景技术

糖化酶，又称葡萄糖淀粉酶[Glucoamylase，系统命名为淀粉α-1.4葡聚糖葡萄糖水解酶，α-1.4-Glucanglucohydrolase(EC.3.2.1.3.)]，是一种具有外切活性的酶，它能把淀粉、糊精、糖原等从非还原性末端水解α-1.4葡萄糖苷键，而得到终产物β-D-葡萄糖，也能缓慢水解α-1.6葡萄糖苷键，转化为葡萄糖，是淀粉转化为葡萄糖过程中的主要酶类之一，糖化酶具有重要商业价值，它已在酿造、食品、医学等工业和农业领域中得到广泛应用。用于生产白酒、黄酒、酒精、醋、啤酒、乳酸钙、柠檬酸、味精等作糖化剂；用于以葡萄糖作发酵培养基的各种抗生素、有机酸、氨基酸、维生素的发酵；与木质素酶、纤维素酶、果胶酶等菌种共同作用，可将秸杆等农业废弃物转变为家畜可利用的饲料；也可用于分解低聚糖；还大量用于生产各种规格的葡萄糖。总之，凡对淀粉、糊精、低聚糖进行酶水解的工业上，都可适用。尽管糖化酶对α-1.6糖苷键的活性只有α-1.4糖苷键的0.2％，这足以在工业糖化过程中影响产量。

目前国内外已筛选出多种糖化酶生产菌，并将其分离提纯。但市场应用的糖化酶主要来源于常温菌，因产品成本高，热稳定性差，货架寿命短，酶活力和产率低而制约糖化酶在农业、工业上的应用。由此可见，热稳定性糖化酶的研究和开发具有重要的商业价值。

嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)是一种广泛分布的，生长上限温度较高的一种嗜热真菌，从该菌中已分离了多种嗜热酶，但未见该菌嗜热糖化酶的报道。

本研究是通过RT-PCR及RACE方法从嗜热毛壳菌Chaetomiumthermophilum获得糖化酶gla基因，将该片段克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K上，获得表达重组质粒pPIC9K/gla，转化毕赤酵母GS115，再从中筛选出一种高效表达糖化酶的酵母基因工程菌。其中一重组子GS-GLA-22经6d诱导，糖化酶蛋白表达量为0.86mg/mL，其酶活为16.73U/mL，用于淀粉加工及其它工业领域，具有非常显著的经济价值和社会价值。

(三)发明内容

本发明的目的是从嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)获得糖化酶gla基因的全长cDNA，命名为gla(DQ104609)，并将gla构建到表达载体pPIC9K上，转化毕赤酵母GS115，培养选择获得产酶量高的毕赤酵母工程菌株。

嗜热毛壳菌gla全长的cDNA为2016bp，包括起始密码子和多聚A尾。开放阅读框部分为1797bp，由此推得具有599个氨基酸的一段序列，将此氨基酸序列在国际基因库中进行检索，发现与15家族糖化酶的同源性很高，其中五个基序P-YFY-W-RDAAL、WG-PQRDGP、D-WEEV、AVG-Y-ED和L-W-YA非常保守表明经过上述克隆步骤得到了嗜热毛壳菌gla基因。该序列如下：

(1)SEQ ID NO1的信息

(a)序列特征

^*长度：2016碱基对

^*类型：核酸

^*链型：双链

^*拓扑结构：线性

(b)分子类型：cDNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：嗜热毛壳菌

(f)序列描述：

1    CTGCCTGACC AGGCAATGCC GCGACGCTAT CATCTGTCAA AAAATGGCTG AACGCCTCTA   60

61   AGTCAGAATC CGTGATGTCC GCATCGGTCC TGTTGGTCTT TGCACAGCAC GAAGTATCGG   120

121  GTGCCGCATC GCACGCACCC CAGTGGGCTA ATCTCCAACG CTCAGCGGTC GATTCCTACA   180

181  TTGAGCGTGA GACCCCTATC GCGTGGAACG CTTTGCTGAA CAACATAGGC CCATGCGGCG   240

241  ATTGCGTCAC GGGAGCGGCC TGCGGAATCG TCGTGGCGAG GCCCTGCAAG TCCGACCCTG   300