[发明专利]孕中期唐氏综合征产前筛查试剂盒

权利要求书

1、孕中期唐氏综合征产前筛查试剂盒，其特征在于：所述试剂盒由AFP标准品、AFP单克隆抗体包被板条、AFP质控品、AFP酶结合物、β-HCG标准品、β-HCG单克隆抗体包被板条、β-HCG质控品、β-HCG酶结合物、标本稀释液、浓缩洗涤液、发光底物液、封板膜，板架组成。

2、如权利要求1所述的孕中期唐氏综合征产前筛查试剂盒的制备方法，其特征在于：所述AFP、β-HCG标准品的制备方法为：先分别将AFP、β-HCG冻干标准品溶解并稀释至所需的最高浓度，再采用倍比稀释法稀释至所需浓度，获得AFP或β-HCG标准品。

3、如权利要求1或2所述的孕中期唐氏综合征产前筛查试剂盒的制备方法，其特征在于：所述AFP、β-HCG单克隆抗体包被板条的制备包括以下步骤：

(1)、采用单克隆抗体技术，先使用AFP或β-HCG纯品按常规对小鼠进行免疫，取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，加以筛选配对，建立AFP和β-HCG单克隆抗体细胞库，然后再经接种小鼠腹腔制备腹水，再将腹水纯化后获得特异性为100％、纯度大于96％的AFP或β-HCG配对单克隆抗体；

(2)、将纯化的AFP或β-HCG单克隆抗体用碳酸盐缓冲液稀释，然后加入包被板条各孔内，经吸附、洗涤、封闭、干燥后获得AFP或β-HCG单克隆抗体包被板条；

(3)、将AFP或β-HCG单克隆抗体包被板条装入专用铝箔包装袋，封口并冷藏备用。

4、如权利要求3所述的孕中期唐氏综合征产前筛查试剂盒的制备方法，其特征在于：所述AFP、β-HCG质控品的制备方法为：先分别将AFP、β-HCG冻干标准品溶解并稀释至所需的浓度，获得AFP或β-HCG质控品。

5、如权利要求4所述的孕中期唐氏综合征产前筛查试剂盒的制备方法，其特征在于：所述AFP、β-HCG酶结合物的制备包括以下步骤：

(1)、称取辣根过氧化物酶倒入一棕色小玻璃瓶内，取1ml双蒸水溶解，用加样器取200ul高碘酸钠溶液，滴入盛辣根过氧化物酶的小瓶内，室温振荡20min；

(2)、振荡好的辣根过氧化物酶溶液取入透析袋，放入配制好的醋酸缓冲液中，4℃冰箱透析过夜；

(3)、取待标记抗体加入另一透析袋中，放入配制好的碳酸盐缓冲液中，置于4℃冰箱内透析过夜；

(4)、次日，取出辣根过氧化物酶溶液，和抗体混匀，放入碳酸盐缓冲液中搅拌透析3小时；

(5)、将透析好的辣根过氧化物酶和抗体溶液，置于棕色小瓶内，加入硼氢化钠溶液充分混匀，用振荡器振荡2小时；

(6)、将葡聚糖凝胶G-200装柱，将上述标记物加于柱顶部，用洗脱液洗脱；

(7)、用小试管依次分段接收流出物，用事先包被好的羊抗鼠板条进行检测，取显兰色板孔对应试管内的酶结合物；

(8)、将收集的酶结合物加入等量甘油混匀，放置于-20℃冰箱保存；

(9)、将酶结合物稀释到工作浓度，配制酶结合物工作液，装入试剂瓶冷藏备用。

6、如权利要求5所述的孕中期唐氏综合征产前筛查试剂盒的制各方法，其特征在于：所述发光底物液包括底物液A和底物液B，其配制包括以下步骤：

(1)、底物液A的配制：

用电子天平准确称取BSA、Tris所需量，加入容量瓶，加适量双蒸水，轻摇使之溶解完全，以双蒸水定容，再用HCl调PH至9.0，用加样器取H2O2加入上述液体中，混匀，将配制好的溶液按照规定量分装到试剂瓶内，拧紧瓶盖放在2～8℃保存备用；

(2)、底物液B的配制：

用电子天平准确称取BSA、Tris所需量，加入容量瓶，加适量双蒸水，轻摇使之溶解完全，以双蒸水定容，再用HCl调PH至9.0，再用电子天平准确称取鲁米诺、对位碘酚倒入容量瓶，充分溶解、混匀，将配制好的溶液按照规定量分装到试剂瓶内，拧紧瓶盖，放在2～8℃保存备用。

7、如权利要求1所述的孕中期唐氏综合征产前筛查试剂盒的使用方法，其特征在于：所述使用方法包括以下步骤：

(1)AFP测定：

a、取出在冷藏环境中贮存的试剂，达到与室温平衡的温度；

b、将浓缩洗涤液按1∶40的比例稀释，摇匀备用，作为应用洗涤液；

c、根据AFP标准品、质控品及待测标本确定所需孔数；

d、AFP标准品、质控品直接取50ul加入相应孔内，用前摇匀；

e、在待测标本孔中先分别加45ul标本稀释液；

f、取5ul血清加入已加标本稀释液的孔内，用移液器吹打，孔内液体由绿色变为蓝色；

g、每孔加入50ul AFP酶结合物，用振荡器振荡30秒钟，盖上封板膜，置37℃水浴1小时；

h、洗板：甩尽板中液体，用洗涤液注满各孔，停留10秒后用力甩去，重复5次后拍干；

i、加底物：根据使用量，将底物液A和底物液B按1∶1充分混匀，每孔加入新配制的发光底物50ul，用振荡器振荡20秒，放入发光仪内，于5～20分钟测量结果；

(2)β-HCG测定：

a、取出在冷藏环境中贮存的试剂，达到与室温平衡的温度；

b、将浓缩洗涤液按1∶40的比例稀释，摇匀备用，作为应用洗涤液；

c、根据β-HCG标准品、质控品及待测标本确定所需孔数；

d、β-HCG标准品、质控品混匀后直接取50ul加入相应孔内；

e、在待测标本孔中先分别加25ul标本稀释液；

f、取25ul血清加入已加标本稀释液的孔内，用移液器吹打几次，孔内液体由绿色变为蓝色；

g、用振荡器振荡30秒钟，盖上封板膜，置37℃水浴1小时；

h、洗板：甩尽板中液体，用洗涤液注满各孔，停留10秒后用力甩去，重复5次后拍干；

i、孔加入50ulβ-HCG酶结合物，37℃水浴15分钟，甩尽板中液体，用洗涤液注满各孔，停留10秒后用力甩去，重复5次后拍干；

j、加底物：根据使用量，将底物液A和底物液B按1∶1充分混匀，每孔加入新配制的发光底物50ul，用振荡器振荡20秒钟，放入发光仪内，于5～20分钟测量结果。