[发明专利]蜂毒肽的分离提纯方法

说明书

技术领域

本发明涉及蜂毒肽的分离提取工艺，特别是用粗蜂毒分离提取蜂毒肽的方法。

背景技术

在蜂毒的众多成份中，以蜂毒肽(melittin)的含量最高，生物活性最强，具有最为广阔的临床前景。国内外虽有其分离提纯方法的报道，但工艺复杂，条件苛刻，难以大量生产；且生产周期较长，一般至少需3天；产品损失严重，蜂毒肽收率仅30％左右，提取纯化成本高。已经公开的专利号：92114271.4“从蜂毒中快速分离蜂肽的方法”，是将粗蜂毒溶解在水中后，使用超滤膜和透析袋使蜂肽分离出来，超滤膜的截流分子量为5000以上，透析袋截流分子量为1000，该方法目的是分离出大分子量可引起过敏反应的非蛋白物质，如采用该方法，蜂毒肽四聚体(分子量为11360)在分离初期就被截流掉，而蜂毒肽四聚体在蜂毒中约占10～20％，所以使得蜂毒肽的提取率比理论提取率低20～30％；该方法为分离方法，蜂毒肽纯度达不到电泳级纯度，因此应用领域大大受到限制。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术存在的缺陷，对现有层析分离法进行改进，提供一种工艺步骤相对少，在提取纯化过程中蜂毒肽损失少，即收率高，生产周期短，提纯后的蜂毒肽纯度达电泳级的蜂毒肽分离提纯方法。

本发明方法是将粗蜂毒用水浸洗，溶媒萃取、凝胶过滤柱层析的方法，从蜂毒中提取蜂毒肽，其特征是：

1)将粗蜂毒加水浸洗，去除不溶物杂质，滤液用乙醇沉淀，去除乙醇水液，沉淀物1加入氢氧化铵与正丁醇溶液萃取，弃除沉淀，蒸馏回收正丁醇，浓缩物加丙酮沉淀得沉淀物2；

2)将沉淀物2溶解于脲的醋酸盐缓冲液A中，在离子交换凝胶CM-Sephrose.FF柱上，用缓冲液A梯度洗脱层析；

3)在离子交换凝胶柱下收集溶血活性最强的吸收峰V时的层析馏份进行浓缩，浓缩液通过葡聚糖凝胶G-10柱脱盐，脱盐浓缩物用丙酮沉淀得到沉淀物3；

4)将沉淀物3溶于盐酸胍、亚硫酸钠和对氯汞苯甲酸混合溶液中，再将溶液浓缩，再通过葡聚糖凝胶柱脱盐，用丙酮沉淀得沉淀物4；

5)将沉淀物4溶解于醋酸盐缓冲液B中，在葡聚糖凝胶G-25柱上，用缓冲液B梯度洗脱层析，在柱下收集溶血活性最强的吸收峰II时的层析馏份进行浓缩，于葡聚糖凝胶柱G-10上脱盐、冷冻干燥即得到蜂毒肽。

在离子交换凝胶柱及葡聚糖凝胶柱上进行层析时使用的缓冲液A和缓冲液B的PH为4.2～5.0，使用梯度混合仪进行梯度洗脱。盐酸胍、亚硫酸钠和对氯汞苯甲酸混合溶液用0.15M的氢氧化铵调整PH值达7.0，盐酸胍、亚硫酸钠和对氯汞苯甲酸的浓度分别为3M、0.055M和0.0023M。在浸洗粗蜂毒时的滤液用20倍的无水乙醇沉淀；中间过程中的脱盐、沉淀，采用3倍量的丙酮进行沉淀。

采用本方法生产的蜂毒肽纯度可达电泳级纯度，满足了更多领域特别是临床应用的技术要求；蜂毒肽的提取率比现有方法均高出7～8％，工艺步骤减化，提纯生产周期比原来减少1.5～2天，提纯成本比原来降低约30％。

下面根据工艺图示结合实施例对本发明作详细描述。

附图为本发明工艺流程示意图。

取粗蜂毒20g加入100ml蒸馏水分三次浸洗，用中性滤纸过滤，蜜蜂蛰针等不溶物杂质弃除。滤液用20倍无水乙醇沉淀，去除乙醇水液，沉淀物1溶于1200ml 0.15M的氢氧化铵中，再加入800ml正丁醇振摇2hr。用分液漏斗分离，沉淀物弃除，蒸馏回收萃取液中正丁醇，浓缩物用三倍的丙酮沉淀；沉淀物2溶解于1000mL含有4mol/L脲的醋酸盐缓冲液中，PH为4.75，此为缓冲液A，上离子交换凝胶CM-Sephrose.FF柱，用缓冲液A+0.5mol/L氯化钠进行梯度洗脱。洗脱液以溶血试验进行蜂毒肽的生物活性跟踪，在离子凝胶柱下收集溶血活性作用最强的吸收峰V时的层析馏份共1000ml，蒸发浓缩至100ml。浓缩液通过葡聚糖凝胶G-10柱脱盐，脱盐浓缩物用三倍的丙酮沉淀。沉淀物3溶解于2000mL的含有3mol/L盐酸胍、55mmol/L亚硫酸钠和2.3mmol/L对氯汞苯甲酸的溶液中，整个溶液用NH₄OH调到pH7.0，在37±2℃下保温2hr，蒸发浓缩溶液至200ml，再通过葡聚糖凝胶柱G-10脱盐，用3倍的丙酮沉淀。沉淀物4溶解于500mL醋酸铵缓冲液(0.05mol/L，pH4.75，此为缓冲液B)中，上葡聚糖凝胶G-25柱，用缓冲液B进行梯度洗脱(用梯度混合器)，洗脱液以溶血试验进行蜂毒肽的活性跟踪，柱下收集溶血活性作用最强的吸收峰II时的层析馏份共800ml，浓缩至100ml，用葡聚糖凝胶G-10柱脱盐，冷冻干燥，最后得到冻干物蜂毒肽9.4g。产物蜂毒肽的收率为4 7％。