[发明专利]一种分离富集磷酸化肽的方法

说明书

技术领域

本发明涉及磷酸化肽的分离富集，具体地说是一种磷酸化肽的高选择性、特异性的富集和纯化方法，该方法应用于蛋白质磷酸化的分析及使用于该方法的磷酸酯锆修饰的载体的构建方法。

背景技术

翻译后蛋白质的修饰是蛋白质组中研究的热点课题。蛋白质磷酸化是最常见，最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式，蛋白质磷酸化和去磷酸化几乎调节者生命活动的整个过程，包括细胞的增殖，发育和分化，神经活动，肌肉收缩，新陈代谢，肿瘤发生等，蛋白质磷酸化还是目前所知道的信号的主要传递方式。

蛋白质磷酸化分析的传统方法如放射性同位素标记，Edman降解以及薄层层析等方法。这些方法操作繁琐，需要高超的实验技巧和较多的蛋白质，而且存在潜在的放射性危险。质谱技术已经发展成为鉴定磷酸化蛋白的重要工具之一。

质谱在鉴定磷酸化蛋白现在仍然是一个巨大的挑战，其具体体现在：第一，磷酸化蛋白在细胞内所有蛋白的低丰度；第二，磷酸化肽的负电性使其在质谱检测中难以质子化；第三，酶解产物中存在的大量的非磷酸化肽的质谱信号通常会淹没磷酸化肽的离子信号。因此，直接用质谱分析复杂蛋白酶解产物中的磷酸化肽是非常困难的，一般要求将磷酸化肽分离纯化后再用质谱分析。

磷酸化肽的富集使用最多的是固定化金属螯合亲和色谱(Immobilized metal affinity chromatography，IMAC)。在这种技术中，一般采用将螯合剂亚氨基二乙酸键合在色谱基质上，然后利用螯合作用将Fe³⁺、Ga³⁺等金属离子固定在色谱基质上。由于磷酸化肽中的磷酸基团与固定化的Fe³⁺等金属离子有较强的相互作用而保留在色谱基质上获得分离。这种方法的缺点是特异性不强，一些酸性肽也会被富集起来，从而干扰对磷酸化肽的检测。为了提高分离富集磷酸化肽的特异性，近来TiO₂和ZrO₂微柱，Al(OH)₃，Fe₃O₄/TiO₂壳孔纳米颗粒等也被用来纯化和富集磷酸肽。但是利用磷酸酯锆与磷酸肽之间的相互作用来富集和纯化磷酸化肽未见报道。

文献1(文献1.Katz.H.E等，“Quaterthiophenediphosphonic(QDP)：ARigid，Electron-Rich Building Block for Zirconium-Based Multilayers”，《Chemistry of Materials》P 699-703(1991年))中记载利用锆与磷酸酯基团之间的相互作用构建磷酸酯锆多层结构的方法；而文献2(文献2.Guillaume Nonglation等，“New approach to OligonucleotideMicroarrays Using Zirconium Phosphonate-Modified Surfaces”，《Journalof American Chemical Society》，P1497-1502(2004年))中记载了利用磷酸酯锆与磷酸基团之间的强相互作用，将磷酸酯锆固载在芯片表面后用于DNA的微阵列的制备。而磷酸酯锆用于磷酸化肽的富集和纯化，文献中未作任何记载，也未作任何启示。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于磷酸酯锆与磷酸化肽相互作用的高选择性、高特异性的分离和富集磷酸肽的新方法。

为实现上述目的，申请人仔细研究了磷酸酯锆作为配位化合物对磷酸化肽的相互作用，发现金属锆离子能够强烈的与磷酸化肽进行配位作用。基于这种独特的极强的配位作用，磷酸化肽能够特异的保留在磷酸酯锆修饰的表面上。

因此，本发明采用的技术方案为：

一种分离富集磷酸化肽的方法，将磷酸酯锆固载于载体表面用于磷酸化肽的富集和纯化。

其中磷酸酯锆固载于载体表面的过程可按本领域常规方法操作。

所述载体为芯片或多孔硅晶片，磷酸酯锆固载于芯片或多孔硅晶片表面进行磷酸化肽的富集和纯化；以芯片为载体时，以直接磷酸化肽被富集在芯片表面，所捕获的磷酸化肽可利用MALDI-TOF质谱实现原位检测，从而避免了样品的损失，适合对微量的磷酸化肽的分析。

所述载体为色谱基质或硅胶，磷酸酯锆固载于色谱基质或硅胶表面作为固定相用于磷酸化肽的富集和纯化；以色谱基质为载体时，磷酸酯锆修饰的色谱基质能够作为色谱填料，用于磷酸化肽的富集和纯化，实现大规模的磷酸化肽的分离提纯。