[发明专利]乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白基因在苜蓿中的诱导性表达

说明书

本发明涉及乙型肝炎病毒包膜小蛋白及中蛋白基因在转基因苜蓿中同时进 行诱导性表达的方法及其应用。上述两个抗原蛋白基因被分别置于苜蓿亚硝酸 还原酶基因启动子操控之下，在正常生长条件下，这两个外源蛋白基因处于沉 默状态，无任何目标蛋白产生。但在硝酸盐的诱导下，亚硝酸还原酶基因启动 子被激活，并随后调控乙肝病毒包膜小蛋白和中蛋白基因在苜蓿体内同时进行 高效表达和积累。人或其他哺乳动物通过直接食用含有这两种重组抗原蛋白的 转基因苜蓿、或通过肠道给药的方式利用自这些转基因苜蓿中部分或完全纯化 出乙型肝炎病毒膜小蛋白及中蛋白作为胶囊、冲剂或其它制剂的主要活性成分 从而可能引起人或其他哺乳动物对乙肝病毒包膜抗原蛋白的免疫应答反应。

乙型肝炎(HBV)是一种广泛传播、世界性分布的传染性疾病，根据世界卫生 组织1996年的报告，1995年全世界死于乙型肝炎的人数约有110万，居各种传 染病死亡人数的第四位，而且近年来有逐渐增加的趋势。中国也是乙型肝炎的 高发区，约50-70％的人群受过HBV的感染，全国目前至少有1.2亿人为乙型肝 炎病毒表面抗原(HBsAg)携带者，其中显现临床症状的病人约有3千万人。

乙型肝炎病毒的感染，不仅可以引起急、慢性病毒性肝炎，而且还与肝硬 化和肝细胞癌的发生、发展有密切关系。乙肝病毒的顽固性和多途径的易传性， 使乙肝成为一个严重的公共卫生问题。迄今为止，由于仍缺乏根治乙型肝炎的 特效药，因此，在日常生活中，如何保护健康人群，预防乙型肝炎的发生就成 为人们要考虑的主要问题之一。

预防乙型肝炎的发生现在可以选择注射疫苗，目前广泛使用的乙肝疫苗为 基因重组多肽疫苗。1986年，世界上第一个基因工程疫苗-酵母菌表达的重组乙 肝疫苗(表达乙肝病毒包膜小蛋白，又称S蛋白)在美国被批准使用，中国也在 上个世纪九十年代初期研制成功了具有世界先进水平的基因工程重组乙肝疫 苗。但这类疫苗仍需多次接种，价格较高，且一些人群(约占15％)在接种后不 能够产生免疫应答反应。

对乙型肝炎病毒粒体结构与组成的研究表明，其最外层的包膜中含有三种 蛋白，依据分子量的大小，分别称之为主要蛋白(S蛋白)、中蛋白(M)和大蛋 白(L)⁽¹⁾，而它们在人体内均能够产生中和抗体。

主要蛋白也称为包膜小蛋白，由226个氨基酸残基组成，为S基因所编码， 是病毒包膜及亚单位颗粒(HBsAg)的主要成分，因其分子量最小，因此又被称为 小蛋白。小蛋白是一种疏水性蛋白，包括糖基化的GP27和非糖基化的P24两种 形式，分子量分别为27kD和24kD而得名。在GP27的N末端146位的天门冬酰 胺上连接着一种复杂的糖基，在122位赖氨酸残基处有胰酶切割位点。S蛋白有 三个疏水区段，分别位于7-23、80-98和169-226，被二个亲水区段分开。疏水 区段的氨基酸比较保守，氨基酸的变异主要发生在亲水区段。

人们常提到的乙肝表面抗原HBsAg实际上是一种构象性抗原，两个小蛋白 分子通过二硫键连在一起，构成的二聚体代表着最小的HBsAg结构单位并具有 完整的HBsAg活性。

中蛋白含有281个氨基酸残基，由前S₂和S基因共同编码，它可以看作是 在小蛋白的N端又另外增加了一个含55个氨基酸残基的S₂蛋白区段，因分子量 居中，故被称为中蛋白。中蛋白有一种非糖基化形式P31，两种糖基化形式GP33 和GP36。GP33含有一个配糖体，GP36有两个配糖体，这两个糖基位于S蛋白的 146位和前S₂区段。由前S₂基因编码的55个氨基酸通常是亲水性的，富含不依 赖二硫键的连续抗原决定簇，具有比小蛋白更强的免疫原性，但易被胃蛋白酶 消化而丧失其活性。此外，前S₂蛋白还含有一个多聚人血清白蛋白受体(PHSA- R)，能特异性地与人和黑猩猩血清中的多聚白蛋白(PHSA)结合，肝细胞本身也 有该受体，多聚人血清白蛋白介导HBV附着肝细胞，这就是HBV易感染肝细胞 的一个重要原因，也是决定HBV嗜肝特点的重要结构基础。