[发明专利]人乳头瘤病毒16型DNA疫苗和基因佐剂及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是采用生物技术的手段获得的一种DNA基因，以及含有所述的基因的疫苗及其用途。 

背景技术

慢性持续性人乳头瘤病毒16型(HPV16)感染是诱发妇女宫颈癌的主要原因，此外HPV感染还与口腔癌、食管癌、阴茎癌、膀胱癌等多种恶性肿瘤发生密切相关。宫颈癌是妇女因恶性肿瘤死亡的主要原因，世界范围内每年新发宫颈癌病例约50万，死亡病例20万，其中2/3的病例在发展中国家，我国是宫颈癌的高发区，在某些落后地区宫颈癌的发病率高居妇女恶性肿瘤的首位。我国每年约有13.9万患者死于宫颈癌。目前晚期宫颈癌的治疗尚无良策，早期宫颈癌及癌前病变的治疗多采用药物腐蚀、激光冷冻及宫颈锥形切除，不能防止HPV16再感染的可能，且技术条件要求相对较高，不适合落后地区推广应用，而对无症状的慢性持续性感染则无对策，因此，研制针对HPV16的治疗疫苗是解决这一问题的根本措施。 

DNA疫苗可较好的诱发机体产生全面持久的免疫反应，特别是特异性细胞免疫，免疫后不产生针对疫苗载体的抗体，可以反复多次应用，能满足肿瘤免疫治疗需反复多次应用的要求，此外，DNA疫苗还具有易于生产，物理性质稳定，人群应用成本低等特点，所以适于在宫颈癌高发的落后地区推广应用。目前多种病毒及肿瘤的DNA疫苗已进行了大规模临床试验，结果表明疫苗的安全性好。研究表明HPV16病毒感染细胞和感染相关肿瘤细胞持续表达含有抗原表位的病毒癌蛋白E7，因此，E7蛋白可作为免疫系统识别这些感染及癌变细胞的靶，对其进行特异性杀伤。由于野生型E7基因有致癌活性，且难以诱发机体产生有效的免疫保护反应，不适于直接用于疫苗的研究。 

因此，在相关的疫苗研究中，采取了许多措施，以消除E7蛋白潜在的致癌活性，包括：1.突变E7蛋白的结合Rb蛋白的结合位点，如C24G，C26G，以消除其转化活性。2.突变E7蛋白的锌指结合区，使E7蛋白难以形成有转化活性功能性的二聚体，这样在降低其稳定性的同时又可促进E7蛋白的迅速降解成抗原表位，增强其免疫原性。3.将E7基因切割成4段后，随意重排，形成只含有E7蛋白线性抗原表位的人工假E7蛋白后再用于疫苗的研究。由于野生性E7基因的免疫原性较弱，为 增强E7基因疫苗的免疫原性，研究者们采取了多种强化策略，与本发明密切相关的有以下几种：1.与结核分枝杆菌HSP70基因融合，构建E7/HSP70基因疫苗。2.采用哺乳类的偏性密码子对E7基因进行优化改造，提高E7抗原基因的体内表达水平。3.采用细胞因子基因作为基因佐剂协同疫苗免疫，被应用于HPV疫苗的基因佐剂有：B7-1，IL-12，IL-2等。IL-15是一种新型的多功能的细胞因子，可刺激T细胞特别是记忆性T细胞、NK细胞等免疫细胞的活化、增殖和表型的维持，而且IL-15的T细胞活化功能，不象IL-2那样易受炎性因子及瘤细胞分泌的免疫抑制因子如TGF-β的影响而受抑制，在瘤细胞抑制因子存在及缺乏IL-2及功能性CD4⁺T细胞时，仍具有促进抗原特异性T细胞及记忆性T细胞活化和增殖的活性，因此，IL-15细胞因子在病毒及肿瘤免疫治疗的研究领域备受重视，以IL-15真核表达质粒转染修饰前列腺癌细胞的免疫治疗研究发现，用人IL-2的信号肽替换天然IL-15的信号肽序列的IL-15表达质粒修饰的癌细胞，可高水平分泌表达IL-15，可诱发机体产生显著的特异抗肿瘤免疫(Suzuki K，Nakazato H，Matsui H，Hasumi M，Shibata Y，FukaboriY，Kurokawa K，Yamanaka H.NK cell-mediated anti-tumor immune response to humanprostate cancer cell，PC-3：immunogene therapy using a highly secretable form of interleukin-15gene transfer.Journal of Leukocyte Biology，69(2001)531.)，另外天然IL-15或含IgK信号肽的表达质粒作为基因佐剂协同疫苗免疫用于病毒及寄生虫的免疫治疗研究发现IL-15可增强疫苗的免疫原性(Xin.Ke-Qin，Hamajima K，sasaki S，Tsuji T，Watabe s，OkadaE.I1-15expression plasmid enhances cell-mediated immunity induced by an HIV-1DNA vaccine.Vaccine.17(1999)858-866)，但以IL-15表达质粒作为疫苗的基因佐剂用于肿瘤疫苗的研究尚未见有报道，更未见有利用人IL-2的信号肽替换天然IL-15的信号肽序列的IL-15表达质粒用于疫苗佐剂的报道。