[发明专利]一种EB病毒蛋白酶联免疫吸附诊断试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.一种EB病毒蛋白酶联免疫吸附诊断试剂盒，包括有：阳性对照血清、阴性对照血清、酶底物、终止反应液、稀释缓冲液、冲洗缓冲液以及EB病毒靶抗原，其特征在于EB病毒靶抗原蛋白为：EBNA1蛋白、Zta蛋白和VCA-p18蛋白，其中所述的Zta蛋白的氨基酸序列为：

MMDPNSTSEDVKFTPDPYQVPFVQAFDQATRVYQDLGGPSQAPL

PCVLWPVLPEPLPQGQLTAYHVSTAPTGSWFSAPQPAPENAYQAYAAPQLFPVSDITQ

NQQTNQAGGEAPQPGDNSTVQTAAAVVFACPGANQGQQLADIGVPQPAPVAAPARRTR

KPQQPESLEECDSELEIKRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLL

KQMCPSLDVDSIIPRTPDVLHEDLLNF。

2.一种EB病毒蛋白酶联免疫吸附诊断试剂盒的制备方法，包括EB病毒重组抗原的制备、纯化标记、效价滴定、包被板制备、封闭、干燥及包装、酶标抗体浓缩液制备、稀释液制备、阳性对照制备、正常对照制备、底物分装、终止液及浓缩液制备等步骤，其特征在于它还包括参考血清的制备，其中EB病毒蛋白重组抗原的制备为：

A、选定EBNA1蛋白的后一截，即：

PVGEADYFEYHQEGGPDGEPDVPPGAIEQGPADDPGEGPSTGP

RGQGDGGRRKKGGWFGKHRGQGGSNPKFENIAEGLRALLARSHVERTTDEGTWVAGVF

VYGGSKTSLYNLRRGTALAIPQCRLTPLSRLPFGMAPGPGPQPGPLRESIVCYFMVFL

QTHIFAEVLKDAIKDLVMTKPAPTCNIRVTVCSFDDGVDLPPWFPPMVEGAAAEGDDG

DDGDEGGDGDEGEEGQE

和Zta蛋白序列，即：

MMDPNSTSEDVKFTPDPYQVPFVQAFDQATRVYQDLGGPSQAPL

PCVLWPVLPEPLPQGQLTAYHVSTAPTGSWFSAPQPAPENAYQAYAAPQLFPVSDITQ

NQQTNQAGGEAPQPGDNSTVQTAAAVVFACPGANQGQQLADIGVPQPAPVAAPARRTR

KPQQPESLEECDSELEIKRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLL

KQMCPSLDVDSI IPRTPDVLHEDLLNF

以及VCA-p18蛋白序列，即：

MARRLPKPTLQGRLEADFPDSPLLPKFQELNQNNLPNDVPREAQ

RSYLVFLTSQFCYEEYVQRTFGVPRRQRAIDKRQRASVAGAGAHAHLGGSSATPVQQA

QAAASAGTGALASSAPSTAVAQSATPSVSSSISSLRAATSGATAAASAAAAVDTGSGG

GGQPHDTAPRGARKKQ

这三种EB病毒蛋白在基因库中的mRNA序列，逆转录酶将之转为cDNA序列；

B、设计可以扩增该cDNA序列的引物、进行序列扩增；

C、将PCR扩增子与谷胱甘肽转移酶基因克隆到Eco R1/Bam HI消化的原核细胞表达pGEX2T质粒载体上，将重组的质粒转至大肠杆菌，诱导已经转到了重组质粒的大肠杆菌，然后收获并裂解细菌，细菌裂解产物经离心后除去碎片而澄清，含融合蛋白的上清液采用谷胱甘肽琼脂糖4B经谷胱甘肽转移酶-谷胱甘肽亲和色谱仪纯化。

3.根据权利要求2所述试剂盒的制备方法，其特征在于EBNA-1引物设计为：

5’-TAC GGA TCC CCT GTA GGG GAA GCC GAT TA-3’

        BamHI

5’-TAC GAA TTC TCA CTC CTG CCC TTC CTC CAC-3’

        EcoRI

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