[发明专利]人G209A突变型α－synuclein转基因SH－SY5Y细胞

说明书

技术领域

本发明涉及我国抗帕金森氏病(Parkinson’s Disease)药物筛选及评价平台的建立。该平台以基因克隆技术和转基因技术为支持，在体外模拟病变巴胺能神经元，可用于筛选抗帕金森氏病药物候选化合物和先导化合物，并可对药物进行药理学评价及深入的机制研究。

背景技术

帕金森氏病又称震颤麻痹(paralysis agitants)，是一种选择性中脑黑质多巴胺能神经元丧失和纹状体多巴胺含量显著减少的神经系统退行性疾病，是中老年人最常见的中枢神经系统变性疾病之一，其发生是遗传易感性与环境有害因子协同作用的结果。由于对其发病机理尚未明了，至今为止对本病均系对症治疗，尚无根治方法可以使神经细胞变性恢复。

目前已发现若干与PD有关的基因，其中α-synuclein基因及其蛋白在PD中起关键作用。α-synuclein基因第209位核苷酸G被A取代(G209A)，导致所编码的氨基酸序列中第53位丙氨酸被苏氨酸取代(A53T)，这种突变发生于家族遗传性PD患者中。研究证明突变蛋白相对于正常蛋白更易于聚集，而α-synuclein的积聚增加与多巴胺神经元的丢失密切相关，许多科学家运用转基因的方法对α-synuclein在PD发病机制中的作用进行了较深入的研究。2000年Masliah研究小组将人的野生型α-synuclein基因转入小鼠的胚胎干细胞，发现所产生的转基因小鼠的脑皮质、海马和中脑黑质神经元中存在含α-synuclein蛋白的包涵体。同时，Feany和Bender在将人野生型和突变型α-synuclein基因转入果蝇后，发现这些果蝇不但出现运动行为障碍，而且有多巴胺神经元选择性变性和死亡，同时部分神经元中出现类似于露易小体的包涵体。这些结果证实α-synuclein蛋白在神经变性死亡中起关键作用。我国杨慧等运用基因转染的方法观察了农药鱼藤酮对高表达的α-synuclein的神经细胞的影响。

SH-SY5Y细胞是人骨髓神经母细胞瘤，在体外可以模拟多巴胺能神经元，用于神经退行性疾病机理等研究。人G209A突变型α-synuclein转基因SH-SY5Y细胞模型，是在细胞水平上模拟PD患者的多巴胺能神经元，在病理表现上可有形态变化、突变α-synuclein蛋白过表达以及相关生理功能改变等。应用此细胞模型可以从多层次多角度进行PD致病机理的研究，为研制和筛选防治PD的新药提供可靠、可行的平台。

发明内容

本发明的目的之一在于从人源神经细胞株中扩增α-synuclein目的基因，避免了常规使用人脑提取带来的伦理问题。

本发明的目的之二是将正常的目的基因进行定点突变，导入细胞后，筛选得到稳定过表达的细胞模型。

本发明的目的之三是利用新建的细胞模型进行抗帕金森氏病药物的筛选评价，及深入的机制研究。

本发明旨在构建一种体外摸拟病变多巴胺神经元的细胞模型，用于进行PD致病机理研究及研制和筛选防治PD的新药提供可靠、可行的平台。

附图说明

图1：总RNA提取

图2：野生型α-synuclein cDNA琼脂糖凝胶电泳；1：DL2000 DNAmarker；2：α-synuclein cDNA。

图3：菌落PCR筛选阳性转化子；M：DL2000 DNA marker；1、2、4、5、6：阳性转化子；3、7、8：阴性转化子。

图4：SOE法α-synuclein定点突变琼脂糖凝胶电泳；1：DL2000 DNAmarker；2：209bp product；3：337 product；4：mutant α-synuclein。

图5：重组质粒3.1-hmα-syn双酶切琼脂糖凝胶电泳；1：DL2000 DNAmarker；2、3：3.1-hmα-syn；4：DL15000 DNA marker。

图6：真核表达质粒DNA测序结果(为cDNA反向序列，红色为突变点)。

图7：Western Blot证明所得五个单克隆中，克隆3有较高的外源基因表达。

具体实施方式

本模型是在构建人G209A突变型α-synuclein基因真核表达质粒基础之上建立起来的。具体方法如下：

1.选择SH-SY5Y细胞，提取总RNA，采用RT-PCR法扩增人野生型α-synuclein基因(图1、图2)。