[发明专利]神经营养因子BDNF、NT－3信号通路新成员Dok5的鉴定和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因克隆和功能、药物研发和治疗领域。具体地说，本发明涉及人基因dok5的克隆，涉及神经营养因子BDNF、NT-3信号通路的新成员Dok5的鉴定和应用，涉及使用酵母双杂交技术、Western Blot技术和细胞荧光技术验证蛋白相互作用，涉及利用Dok5基因和蛋白以及Trk-Dok5介导的BNDF、NT-3信号通路进行药物设计以及临床诊断和治疗等领域。

背景技术：

神经系统是目前所知的最为复杂的系统之一。神经系统相关疾病一直困扰着人类健康。尤其是随着全球逐渐步入老龄化社会，神经系统退行性疾病例如阿尔茨海默病(Alzheimer’sDisease)、帕金森病(Parkinson’s Disease)等已经成为威胁人类健康和社会正常发展的重要因素。寻找和开发治疗神经系统相关疾病的新药物、新方法已经成为各国和各大制药巨头的研发重点和热点。

神经退行性疾病多是由于神经元的凋亡引起的，如阿尔茨海默病表现为广泛的大脑皮层神经元丧失，尤其是海马和基底前脑的胆碱能神经元的退化；帕金森病表现为黑质纹状体多巴胺能神经元的大量缺失。除了环境中的氧化应激损害导致的神经元凋亡，随着年龄的增长，中枢神经系统的神经元不能获得足够的营养因子，也是神经元大量死亡的重要原因。而如果为神经元提供充足的营养因子就能够有效维持神经元的存活，延缓神经退行性疾病的进程。因此，有效增加神经元外部环境的营养因子浓度或是增加神经元对有限的营养因子的反应性，成为治疗神经退行性疾病重要的选择方案之一。

神经营养素家族营养因子是神经系统重要的营养因子，参与神经细胞的增殖、发育、分化、迁移和损伤后再生等。该家族因子BDNF(brain derived neurotrophic factor)和NT-3(neurotrophin-3)能够有效保护神经元，维持神经元的存活，并参与神经损伤后的修复过程。目前，已有美国医药公司正在进行BDNF、NT-3的开发与临床实验。

本发明克隆了人神经系统高表达的dok5基因，该基因编码一个细胞信号蛋白。我们通过酵母双杂交实验证明了Dok5参与BDNF、NT-3信号转导。随后我们通过突变分析、pulldown实验、免疫共沉淀实验证明Dok5以依赖于受体磷酸化的方式结合BDNF、NT-3的受体TrkB、TrkC胞内区的NPQY模体。在PC12细胞中Dok5与TrkB、TrkC受体共定位。通过对信号通路的检测，我们发现Dok5能够有效提高BDNF、NT-3诱导的MAPK信号通路的活化程度和延长其活化时间。因此，Dok5参神经营养因子BDNF、NT-3的信号转导，并可以有效增强其效果。Dok5作为BDNF、NT-3信号通路新成员的发现，为治疗神经退行性疾病提供了新的靶点，以TrkB、TrkC和Dok5为把点的药物设计可以增强神经元对有限的BNDF、NT-3的反应性，具有十分广阔的临床应用前景。

发明内容

本发明是在研究神经营养因子BDNF、NT-3信号通路在神经系统中的功能和应用的基础上进行的。通过生物信息学分析和相关文献分析，我们鉴定了BDNF、NT-3信号通路的一个新成员Dok5。Dok5是神经系统高表达的接头蛋白，是细胞信号网络的重要成员之一。已有文献报道Dok5参与神经系统重要的营养因子神经胶质细胞衍生生长因子(GDNF，glial cell line-derivedneurotrophic factor)的信号传导，并可能参与神经元的发育分化。

本发明克隆了人dok5基因，并首次证明Dok5能够参与神经营养因子BDNF、NT-3的信号通路。通过酵母双杂交实验，我们证明Dok5通过PTB结构域结合神经营养因子BDNF、NT-3受体TrkB、TrkC的胞内区。随后通过突变分析，我们确定Dok5以依赖于受体磷酸化的方式结合TrkB、TrkC受体胞内区的NPQY模体。GST pulldown实验证明GST-Dok5-PTB融合蛋白可以在体外结合BDNF、NT-3刺激后活化的TrkB、TrkC受体。通过免疫共沉淀实验进一步证明，Dok5能够结合磷酸化的TrkB、TrkC受体NPQY模体。PC12细胞系是研究神经细胞体外分化的很好的模型，细胞荧光实验显示Dok5与TrkB、TrkC受体在分化的PC12细胞中共定位。通过对MAPK信号通路的检测，我们发现Dok 5能够有效增强BDNF、NT-3介导的MAPK信号通路的活化并延长该通路的活化时间。