[发明专利]酿酒酵母细胞培养分泌液制备方法及其抗DNA病毒和促肝细胞生长的用途

说明书

技术领域

本发明涉及酿酒酵母细胞培养分泌液制备方法及其抗DNA病毒和促肝细胞生长的用途，属于生物医药领域。

背景技术

乙型肝炎病毒(HBV)属于DNA病毒，其造成的急慢性肝炎、肝坏死及肝细胞癌对人类健康危害极大，每年死于肝癌的人数达100万以上。以往由于HBV受宿主范围狭窄和缺乏体外培养系统的限制，阻碍了抗HBV药物的研究。近年来，随着HBV DNA转染细胞系的相继建立，为抗HBV药物筛选提供了必要的条件。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种具有药用价值的酿酒酵母细胞培养分泌液。

本发明要解决的第二个技术问题是提供这种酿酒酵母细胞培养分泌液的制备方法。

本发明要解决的第三个技术问题是提供这种酿酒酵母细胞培养分泌液抗DNA病毒和促肝细胞生长的用途。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

酿酒酵母细胞培养分泌液，采用以下方法制备：挑取酿酒酵母单克隆菌落，接种于5ml的PD培养液中，30℃振摇过夜；取1毫升转接到500毫升的PD培养液中，28-30℃(优选28℃)振摇40-60小时(优选48小时)；用0.2微米的滤膜过滤除菌即得。

所述PD培养液的配方和制法为：水解乳蛋白10-20克；葡萄糖5-15克；氯化钠7-12克；溶于灭菌水1000毫升；高压8磅40分钟灭菌。调PH值7-8。

最优选的配方为：水解乳蛋白15克；葡萄糖10克；氯化钠9克；溶于灭菌水1000毫升。调PH值7.5。

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号为CICC1001，培养温度为28～30℃。我们还发现其他来源的酿酒酵母也具有本发明公开的作用。

酿酒酵母细胞培养分泌液的制备方法，挑取酿酒酵母单克隆菌落，接种于5ml的PD培养液中，30℃振摇过夜；取1毫升转接到500毫升的PD培养液中，28-30℃(优选28℃)振摇40-60小时(优选48小时)；用0.2微米的滤膜过滤除菌即得。

所述PD培养液的配方和制法为：水解乳蛋白10-20克；葡萄糖5-15克；氯化钠7-12克；溶于灭菌水1000毫升；高压8磅40分钟灭菌。调PH值7-8。本发明可以扩大规模进行生产，例如使用工业化生产工艺，则培养基的用量和接种量均有适当比例的增加。

最优选的配方为：水解乳蛋白15克；葡萄糖10克；氯化钠9克；溶于灭菌水1000毫升。调PH值7.5。

酿酒酵母细胞培养分泌液具有抗DNA病毒的作用，可以用来制备治疗DNA感染引起的疾病的药物。所述DNA病毒包括疱疹病毒、乳头状瘤病毒、肝炎病毒等，其中肝炎病毒为乙型肝炎病毒(HBV)。

本发明提供的酿酒酵母细胞培养分泌液还具有促肝细胞生长的作用，尤其可促进和修复人为造成的肝细胞机械性损伤，可以用来制备治疗肝细胞损伤相关疾病的药物。

本发明药效学试验采用HBV DNA全基因组的重组质粒转染人的肝癌细胞HepG2获得的2215细胞，该细胞能向培养上清中稳定的分泌HBsAg和HBeAg及完整的HBV颗粒，是目前国内外公认的用于体外筛选抗HBV药物较理想的实验模型。

本发明采用2215细胞测定酿酒酵母细胞培养液的毒性反应，证实该分泌液不仅没有毒性作用，反而还对还具有促进作用，这可能是由于酿酒酵母细胞培养分泌液抑制了HBV DNA的复制而使2215细胞趋向正常细胞所致。当酿酒酵母细胞培养液稀释1∶1000或1∶2000时对2215细胞分泌HBsAg和HBeAg的抑制率分别为52.11％和59.85％，提示本发明在体外达到一定浓度时有较好的抗HBV活性。

以含有酿酒酵母细胞培养液的培养液培养大鼠原代肝细胞的实验证明，本发明具有促肝实质细胞生长，延长培养时间，维持细胞正常形态和抑制肝细胞纤维化等作用。

本发明的优点是：本发明意想不到地发现经过PD培养基培养和简单纯化后的酿酒酵母细胞培养分泌液具备显著的抗DNA病毒和促肝细胞生长的作用，为治疗乙型肝炎和肝损伤性疾病提供了新的治疗药物。

下面结合较佳实施方式对本发明作进一步说明，凡依照本发明公开内容所作的本领域任何等同替换，均属于本发明的保护范围。

具体实施方式

实施例1.制备酵母细胞培养分泌液

一.材料

PD培养基：水解乳蛋白15克(购于北京双旋微生物培养基制品厂)

葡萄糖10克(北京博大生物科技有限公司)