[发明专利]铜诊断/测定试剂盒及铜浓度测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种铜诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定铜浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。

背景技术

正常成人体内含铜量为80～150mg，血循环铜占总铜量的10％。血浆中约95％铜a₂球蛋白牢固结合，称为铜蓝蛋白(Ceruloplasmin)，经酸处理后才能与铜试剂反应。其余5％为游离铜。许多酶都含有铜，如细胞色素氧化酶、超氧化物岐化酶、尿酸氧化酶、赖氨酸氧化酶、酪氨酸酶、多巴胺β-羟化酶等。与白蛋白疏松结合的铜是运输、吸收、排泄的重要形式和中间环节，也是合成各种细胞蛋白的原料。其它铜蛋白还有血铜蛋白、肝蛋白和脑铜蛋白。铜参与造血过程，主要影响铁的吸收、运送和利用。

生物体液与组织中铜的测定方法包括分光光度法，火焰和无火焰原子吸收分光光度法、发射光谱法、中子活化分析法和阳极溶出伏安法等。铜的分光光度法都是利用铜形成有色络合物。火焰原子吸收法利用铜离子在火焰中被还原为Cu⁰，从铜空心阴极灯发出的光波Cu⁰吸收的量与浓度成正比，用于血清、尿、组织中铜的测定。阳极溶出伏安法是将铜离子作为汞齐被镀于阳极上，电压变得更正，使Cu从阳极“剥下”或再次溶解，形成的电流与Cu的浓度成正比，广泛应用于环境分析。中子活化分析是利用中子将⁶³Cu转变成不稳定⁶⁴Cu同位素，后者衰变时释放γ射线可在1。34MeV计数，应用于特定研究中心。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶循环扩增法(Enzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic ColorimetricMethod)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定铜浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的铜诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行铜浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。

本发明铜浓度测定方法原理如下：

这种方法应用需要铜激活的赖氨酸氧化酶(lysine oxidase；EC1.4.3.13；EC 1.4.3.14)酶(偶)联丙氨酸脱氢酶(alanine dehydrogenase；EC 1.4.1.1)、甘氨酸氧化酶(glycine oxidase；EC 1.4.3.19)酶促反应连续监测法。赖氨酸氧化酶作为作用酶，功能为将赖氨酸酶解产生氨。丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶作为循环酶：丙氨酸脱氢酶的酶促作用使氨产生丙氨酸；甘氨酸氧化酶再将丙氨酸再次变回氨，使氨不断地被重复循环利用。丙氨酸脱氢酶同时又作为显色酶，将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为氧化型辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算铜的浓度大小。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明铜诊断/测定试剂盒较为理想：

缓冲液                   100mmol/L

稳定剂                   50mmol/L

还原型辅酶               0.25mmol/L

赖氨酸                   20mmol/L

丙酮酸                   16mmol/L

赖氨酸氧化酶             12000U/L

丙氨酸脱氢酶             16000U/L

甘氨酸氧化酶             16000U/L

本发明的铜诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括：

缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、赖氨酸、丙酮酸、赖氨酸氧化酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶。

试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

也可以将上述单剂试剂配成如双剂试剂：

试剂1

缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、赖氨酸、丙酮酸。

试剂2

缓冲液、稳定剂、赖氨酸氧化酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶。