[发明专利]离子钙诊断/测定试剂盒及离子钙浓度的测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种离子钙诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定离子钙浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。

背景技术

血液中的钙几乎全部存在于血浆中，血浆钙有两种形式：1非扩散性钙，也称结合钙。它同蛋白质结合，不能透过毛细血管壁，不具有生理活性，约占钙的40％；2可扩散性钙，包括离子化钙，约占总钙的46％，是具有生理活性的部分。与碳酸氢根、磷酸盐、柠檬酸、乳酸等阴离子结合的钙，约占总钙的14％。非扩散性钙与扩散性钙可以互相转变并保持动态平衡。

钙的生理功能主要为：1构成骨骼和牙齿，维持和修补骨骼的完整性；2保持神经肌肉的正常应激性；3传导神经冲动；4维持细胞的正常生理通透性；5参与血疑过程；6激活某些酶的活性，如琥珀酸脱氢酶、ATP酶等；7对心肌收缩的影响，ca²⁺有利于心肌收缩，它和有利于心肌舒张的K⁺相拮抗，从而维持心肌正常的收缩与舒张。血钙与骨骼中的钙保持动态平衡。血钙含量的变化常能反映出骨组织的代谢情况，因此测定血钙对某些疾病的诊断有帮助。

总钙的测定方法很多，概括起来有滴定法(氧化还原滴定法、络合滴定法)，比色法(方法很多，最常用又便与自动化操作的是邻甲酚酞合络酮法、甲基麝香草酚蓝法、偶氮胂III法等)，火焰光度法、原子吸收分光光度法、同位素稀释质谱法、酶法。国际临床化学联合(IFCC)推荐的钙测定决定性方法为同位素稀释质谱法(IDMS)，参考方法为原子吸收分光光度法。世界卫生组织(WHO)推荐的中等实验室用的常规方法为邻甲酚酞络合酮法(O-CPC)。

离子钙的测定方法大致有：生物学法、透析法、超滤法、金属指示剂法、离子选择性电极法.目前应用最多的是离子选择性电极法(ISE)。此方法简便、迅速、重复性好，正确和敏感性高。测定结果不受血浆蛋白质的影响，能反映机体钙代谢的实际情况。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶联法(Couple Reaction)技术，连续监测通过酶联反应生成吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye)，所导致在400-700nm波长处吸光度的上升，得以测定离子钙浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的离子钙诊断/测定试剂盒，采用该试剂盒不仅可以在可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行离子钙浓度测定，而且测定速度快、灵敏度大、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。

本发明离子钙浓度测定方法原理如下：

还原型辅酶+氧NAD(P)H氧化酶/Ca²⁺辅酶+过氧化氢

过氧化氢+还原型色原体组合过氧化物酶吲嗒胺色原或醌亚胺色原+水

这种方法应用NAD(P)H氧化酶(NAD(P)H oxidase；EC 1.6.3.1)需要钙离子才能激活酶活性的酶促反应速率比色法。在钙离子的催化下，NAD(P)H氧化酶(NAD(P)H oxidase；EC 1.6.3.1)酶解反应产生过氧化氢，再通过(偶)联合过氧化物酶(peroxidase；EC 1.11.1.7)的作用，最终将无色的还原型色原体组合氧化成有色的染料，从而可以通过可见光分析仪器，在400700nm(根据还原型色原体组合的不同而定)波长处，测定染料，吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye)，含量高低的光吸收大小，通过测量400-700nm(根据还原型色原体组合的不同而定)处吸光度上升的速度，得出离子钙浓度大小测定结果。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，如下成分关系的本发明离子钙浓度诊断/测定试剂盒较为理想：

缓冲液                                 100mmol/L

稳定剂                                 50mmol/L

还原型辅酶                             0.25mmol/L

NAD(P)H氧化酶                          6000U/L

过氧化物酶1                            5000U/L