[发明专利]腺苷脱氨酶诊断试剂盒及腺苷脱氨酶活性浓度测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种腺苷脱氨酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定腺苷脱氨酶活性浓度的方法，属于医学检验测定技术领域。

背景技术

医学研究表明，腺苷脱氨酶是一种与机体细胞免疫活性有重要关系的核酸代谢酶。因此，腺苷脱氨酶活性的测定被作为良恶性胸腹水，脑脊液鉴别诊断，重症联合免疫缺陷病(SCID)，急、慢性肝炎，肝硬化，肝癌等疾病鉴别的重要诊断标志。

腺苷脱氨酶的活性测定方法主要有放射核素法、物理方法和生化法。据申请人了解，目前国际上普遍采用紫外光法，其测定原理是：腺苷(白色结晶粉末)+水(H₂O)腺苷脱氨酶  肌苷(Inosine)+氨离子(NH₄⁺)，此反映过程生成的肌苷会在波长为265nm处显现，因此可以通过测定此波长处吸光度的大小直接反映腺苷脱氨酶活性的大小。然而，此方法无法用一般医院的可见光分析仪测定，而需要使用专门的紫外光分析仪，因此难以切实推广应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶循环扩增法(Enzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic ColorimetricMethod)及酶联法(Couple Reaction)技术，连续监测通过酶联反应生成吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye)，所导致在400-700nm波长处吸光度的上升，得以测定腺苷脱氨酶活性浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的腺苷脱氨酶诊断试剂盒，采用该试剂盒不仅可以在可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行腺苷脱氨酶活性浓度测定，而且测定速度快、灵敏度大、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。

本发明腺苷脱氨酶活性浓度测定方法原理如下：

腺苷+水    腺苷脱氨酶    肌苷+氨离子

氨离子+丙酮酸+还原型辅酶    丙氨酸脱氢酶    L-丙氨酸                                           +水+辅酶

丙氨酸+水+氧    甘氨酸氧化酶    氨离子+丙酮酸+                                                过氧化氢

过氧化氢+还原型色原体组合    过氧化物酶    吲嗒胺色原或                                                 醌亚胺色原+水

腺苷脱氨酶(adenosine deaminase；EC 3.5.4.4)及丙氨酸脱氢酶(alanine dehydrogenase；EC 1.4.1.1)作为作用酶，功能为将腺苷经二步酶解产生丙氨酸。甘氨酸氧化酶(glycine oxidase；EC 1.4.3.19)作为循环酶：甘氨酸氧化酶的酶促作用将丙氨酸再次变回氨离子及丙酮酸，使氨离子及丙酮酸不断地被重复循环利用，并不断地循环产生过氧化氢。过氧化物酶(peroxidase；EC 1.11.1.7)作为显色酶，最终通过和过氧化氢的作用将无色的还原型色原体组合氧化成有色的染料，从而可以通过可见光分析仪器，在400-700nm(根据还原型色原体组合的不同而定)波长处，测定染料，吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye)，含量高低的光吸收大小，通过测量400-700nm(根据还原型色原体组合的不同而定)处吸光度上升的速度，可以测算5’核苷酸酶的活性浓度大小。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，如下成分关系的本发明腺苷脱氨酶诊断试剂盒较为理想：

缓冲液            100mmol/L

稳定剂            50mmol/L

过氧化物酶        30000U/L

还原型辅酶        0.25mmol/L

丙氨酸脱氢酶      8000U/L

甘氨酸氧化酶      12000U/L

腺苷              8mmol/L

丙酮酸            16mmol/L