[发明专利]镁诊断/测定试剂盒及镁的浓度测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种镁诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定镁浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。

背景技术

镁测定方法很多，概括起来有比色法、荧光法、离子层析法，离子选择性电极法(ISE)、酶法、原子吸收分光光度法(AAS)、同位素稀释质谱法(ID-MS)等。

镁测定的决定性方法是同位素稀释质谱法，参考方法是原子吸收分光光度法法。这些方法虽然结果准确，但设备复杂，费用昂贵，不适合常规实验室和自动分析。

比色法是应用最广泛的方法，包括甲基麝香草酚蓝法(MTB)、达旦黄法、邻甲酚酞络合酮法(OCPC)、钙镁试剂(Calmagite)法、以及新近报道的2-(8’-羟基喹啉-5’-磺酸-7’-偶氮)-变色酸(8Q5SAC)法。比色法操作简便，费用低，适合常规实验室应用。但存在试剂空白吸光度高，胆红素和其它阳离子的干扰，试剂稳定性差及试剂中含有腐蚀性或毒性成分等缺点。

离子选择性电极法可测定生理溶液中镁离子活度。采用中性载体(ETH7025)液膜离子选择电极测定准确度较高。但还存在钙干扰(生理范围内)Ca²⁺最大干扰10％等不足。

离子色谱法测定血清总镁在测定之前需对样本进行预处理，包括酸化稀释和过滤。Thienpont等使用该法对五种国际标准和技术学会用火焰原子吸收分光光度法的定值血清进行了分析，结果平均偏差仅为0.35％，认为离子色谱法可作为总镁测定有价值的参考方法。

Mg²⁺的酶法测定技术在近几年研究非常活跃，取得较大进展。已应用于Mg²⁺测定的酶学方法有：①己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶偶联法；②甘油激酶、磷酸甘油氧化酶和过氧化物酶偶联法；③葡萄糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶偶联法；④酶联化学发光法；⑤磷酸葡萄糖变位酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶偶联法；⑥异柠檬酸脱氢酶法；⑦丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶偶联法。酶法检测镁结果准确，干扰影响小，适合于自动化分析。由于酶试剂不断更新，使测定快速、灵敏，操作简便，因而具有较好的应用前景。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定镁浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的镁诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行镁浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。

本发明镁浓度测定方法原理如下：

腺苷二磷酸+甘油-3-磷酸 甘油激酶/Mg²⁺甘油+腺苷三磷酸

甘油+辅酶  甘油脱氢酶  甘油酸+还原型辅酶

这种方法应用需要镁离子激活的甘油激酶(Glycerokinase；EC2.7.1.30)酶(偶)联甘油脱氢酶(glycerol dehydrogenase；EC 1.1.1.6；EC 1.1.1.72；EC 1.1.1.156；EC 1.1.99.22)酶促反应连续监测法。甘油激酶酶解甘油-3-磷酸产生甘油，再通过(偶)联合甘油脱氢酶的作用，最终将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的速度，通过测量340nm处吸光度上升的速度，可以测算镁的浓度大小。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明镁诊断/测定试剂盒较为理想：

缓冲液                         100mmol/L

稳定剂                         50mmol/L

辅酶                           3mmol/L

甘油激酶                       12000U/L

甘油脱氢酶                     20000U/L

腺苷二磷酸                     6mmol/L

甘油-3-磷酸                    10mmol/L