[发明专利]锰诊断/测定试剂盒及锰浓度测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种锰诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定锰浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。

背景技术

锰作为一种微量元素在人体中是不可或缺的必需成分，同时也是对人体有毒的物质。在自然状态下，以两价、三价和四价形式存在，氧化程度越低，毒性越高。通常锰有八种不同的氧化状态。锰的生物学意义是作为人体中辅助因子有多种多样的功能。然而，在许多酶反应激活中，Mn²⁺和Mg²⁺可互相替代。

常用石墨炉原子吸收分光光度测定法、原子发射ICP-OES。中子激发分析(NAA)是最好的方法，但仅能在一些条件好的实验室才能测定。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定锰浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的锰诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行锰浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。

本发明锰浓度测定方法原理如下：

草酰乙酸 草酰乙酸脱羧酶/Mn²⁺ 丙酮酸+二氧化碳

丙酮酸+L-精氨酸+还原型辅酶 章鱼碱脱氢酶N2-(D-1-羧乙基)-L-精氨酸+辅酶+水

这个方法应用需要锰离子激活的草酰乙酸脱羧酶(oxaloacetatedecarboxylase；EC 4.1.1.3)(偶)联章鱼碱脱氢酶(octopine dehydrogenase；EC 1.5.1.11)酶促反应速率比色法。草酰乙酸脱羧酶促使草酰乙酸发生脱羧作用产生丙酮酸，再通过章鱼碱脱氢酶的作用，最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算锰的浓度大小。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明锰诊断/测定试剂盒较为理想：

缓冲液                    100mmol/L

稳定剂                    50mmol/L

还原型辅酶                0.25mmol/L

草酰乙酸                  25mmol/L

精氨酸                    40mmol/L

草酰乙酸脱羧酶            12000U/L

章鱼碱脱氢酶              16000U/L

本发明的锰诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括：

缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、草酰乙酸、精氨酸、草酰乙酸脱羧酶、章鱼碱脱氢酶。

试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：

试剂1

缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、草酰乙酸、精氨酸。

试剂2

缓冲液、稳定剂、草酰乙酸脱羧酶、章鱼碱脱氢酶。

还原型辅酶、草酰乙酸、精氨酸、草酰乙酸脱羧酶、章鱼碱脱氢酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂：

试剂1

缓冲液、稳定剂、还原型辅酶。

试剂2

缓冲液、草酰乙酸、精氨酸。

试剂3

缓冲液、稳定剂、草酰乙酸脱羧酶、章鱼碱脱氢酶。

还原型辅酶、草酰乙酸、精氨酸、草酰乙酸脱羧酶、章鱼碱脱氢酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定锰浓度的方法，其还原型辅酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH中的一种。

具体实施方式

下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。

实施例一