[发明专利]一种体外定向进化获取高活力超广谱β－内酰胺酶的方法

说明书

技术领域

本发明体外定向进化TEM-1β-内酰胺酶获取高活力超广谱β-内酰胺酶(extended-pectrum β-lactamases，ESBL)的方法，属于医药生物工程技术领域，更具体地说主要采用了易错PCR和DNA改组这两种定向进化的策略，对本室构建的一株含TEM-1基因的菌株进行了改造。对突变菌株及其野生株进行酶的底物谱酶及其总活力进行比较，突变的底物谱扩大，对突变菌株及其野生株进行酶的底物谱酶及其总活力进行比较，突变使原有的底物谱扩大，对代表性的第三代β-内酰胺抗生素CAZ，CTX由不能降解提高到比活为43IU/mg和78IU/mg。

背景技术

体外定向进化作为近几年发展起来的一种蛋白质改造新策略，可以在未知目标蛋白三维结构信息和作用机制的情况下，通过对编码基因的随机突变、重组和定向筛选，获得具有改进功能或全新功能的蛋白质，使几百万年的自然进化过程在短期内得以实现，因而是发现新的生物活性分子和反应途径的重要方法，已在短短几年内取得了令人瞩目的成就。

体外定向进化两种最常用技术是易错PCR技术及其DNA改组技术：易错PCR技术是一种相对简单、快速廉价的随机突变方法，通过改变PCR反应条件，使扩增的基因出现少量碱基错配，从而导致目的基因的随机突变(NakaniwaT，TadaT，TakaoM，et al.An invitro evaluation of a the r-mostablepectate lyase by using error-prone PCR.Enzymatic，2004，27：127-131.)。DNA改组由美国Stemmer于1994年首次提出：对一组基因群体(进化上相关的DNA序列)进行重组创造新基因的方法(Stemmer WP.Rapid evolution of a proteininvitro by DNA shuffling.Nature，1994，370(6488)：389-391.)。体外分子定向进化策略证明进化可以发生在自然界，也可以发生在试管中。

TEM-1型β-内酰胺酶是一类能水解青霉素类、头孢菌素类和单酰胺类抗生素内酰胺环的酶，其特征是能水解第二代及其以下头孢菌素β-内酰胺类抗生素酰胺环的酶。ESBL和广谱β-内酰胺酶(TEM-1、SHV-1)相比，其特征是能水解第三代以上头孢菌素内酰胺环的酶。绝大部分该类酶是由质粒介导的周质酶，能分泌到细胞周质中切断信号肽成为成熟酶，水解β-内酰胺类抗生素。TEM-1酶基因在天然菌中广泛存在，并已经能够在大肠杆菌中高效的表达(Sosa-PeinadoA，Mustafi D，Makinen MW.Overexpression and biosynthetic deuteriumenrichment of TEM-1 beta-lactamase for structural characterization bymagnetic resonance methods，Protein Expr Purif.2000，19(2)：235-245.)，但是能够降解CAZ等第三代以上头孢菌素并能在大肠杆菌中高效的表达的TEM型酶基因却很少。因此，采用定向进化的方式获取TEM-1酶的突变库，通过抗生素筛选获取能高效降解CAZ等第三代以上头孢菌素的重组大肠杆菌不失为一种简便、高效的方法。定向进化技术获取的突变酶具有更广的底物谱，比TEM-1酶更适合作为一种抗生素伴侣，用于预防及其治疗因广谱β-内酰胺类抗生素治疗造成的肠道菌群失调。

发明内容

本发明的目的就是为了解决上述问题，提供一种采用定向进化的方法，改造TEM-1酶基因使之表达产物对以CAZ为代表的第三代及其以上β-内酰胺抗生素的活性提高，从而满足将该酶开发成为一种抗生素伴侣的需要。该方法能为任何一种β-内酰胺酶提高其对特定底物活性提供范例。

本发明的实现方法：

(1)采用PCR技术，以筛选的耐β-内酰胺抗生素的大肠杆菌总DNA为模板，设计引物，扩增获取β-内酰胺酶基因，插入pMD18T克隆载体上，转入E.coliJM109，测序鉴定为TEM-1基因。

(2)配制易错PCR缓冲体系：在普通PCR反应底基础上添加MnCl2、MgCl2、KCl、明胶、dCTP、dTTP等物质。

(3)把易错PCR产物及其pET24a表达载体用NdeI、XhoI双酶切后连接，连接产物转入E.coliBL21(DE3)构建易错PCR突变库，采用抗生素筛选的方式获取对头孢他啶活性较高的菌株。