[发明专利]利用转基因烟草根系及组织分泌表达枯草芽孢杆菌纤溶酶

说明书

技术领域

本发明涉及利用转基因植物生产外源蛋白，具体地涉及利用转基因烟草根系及组织分泌表达枯草芽孢杆菌纤溶酶。

背景技术

利用转基因植物生产医药、工业、食品以及环境用外源蛋白，是植物生物技术研究和开发的热点之一。目前已经能够利用植物生产多种外源蛋白，如白介素、PHB等。尽管如此，利用植物生产外源蛋白还存在产量低、下游加工成本较高以及外源蛋白在植物体内累积过程中的降解、转化和对植物体造成的胁迫、伤害等诸多亟需解决的问题。通过外源蛋白在植物组织中的分泌表达可望成为解决或缓解上述问题的重要途径。    

枯草芽孢杆菌纤溶酶(Bacillus subtilis fibrinolytic enzyme，BSFE)是枯草芽孢杆菌N18分泌的碱性丝氨酸蛋白酶，具有强烈的纤溶活性，经口服后也可发挥纤溶作用。临床上可用于预防和治疗血栓栓塞性疾病。同时由于其分子量相对较小，且易于检测，可作为理想的研究植物分泌表达的外源蛋白。

目前，利用转基因烟草根系及组织分泌表达枯草芽孢杆菌纤溶酶尚未见报道。

发明内容

(一)要解决的技术问题

本发明的目的是提供一种利用转基因烟草根系及组织分泌表达枯草芽孢杆菌纤溶酶的方法。

(二)技术方案

本发明所述的利用转基因烟草根系及组织分泌表达枯草芽孢杆菌纤溶酶的方法，它包括以下步骤：

(1)克隆枯草芽孢杆菌纤溶酶基因及其前导肽编码序列；

(2)构建植物表达载体；

(3)将表达载体导入烟草植株中表达；

(4)测定枯草芽孢杆菌纤溶酶在转基因烟草中的分泌表达。

本发明所述的方法，其具体做法为：

根据已知的BSFE基因及其前导肽序列，设计PCR引物：

引物I 5`GAG TTC ATG AGA AGC AAA AAA TTG TGG ATC AG 3`

引物II 5`CGC GGA TCC GCC GGA ACA TCA GGA TGC TG 3`。

以pUBH为模板PCR克隆BSFE基因及其前导肽编码序列，通过中间载体pMOGEN18(Ampr)，转化大肠杆菌DH5α，在LB1、LB2培养基中，经Amp筛选获得阳性克隆pSW18。再通过中间载体pSE420转化大肠杆菌DH5α，在LB1、LB2培养基中，经Amp筛选获得阳性克隆pSW420。通过穿梭载体pMOG402转化农杆菌EHA105，在LB3、LB4培养基中，经Kan筛选获得阳性克隆pSW402，获得植物转化载体EHA105/pMOG402-35S-BSFE-Kan(质粒图谱如附图1所示)。

本发明所述的方法，其中，表达载体是通过农杆菌介导进入烟草植株的，方法为常用的叶圆片法。

本发明所述的方法，其中，转基因烟草栽培的具体做法为：

1、将充分诱导形成不定根的转基因烟草冲洗去除残留琼脂，转接入过渡培养基质中，生长条件由25℃16/8h光暗条件逐渐改变为自然生长环境，时间约30d，然后移栽到大田，按常规栽培。

2、转基因烟草水培及其样品制备：将充分诱导形成不定根的转基因烟草冲洗去除残留琼脂，转接入水培液中，密闭在湿润的透明培养钵内，在25℃16/8h光暗条件下培养15d，间歇摇匀容器内培养液，每日取200μl培养液-70℃冻存，并补充等体积培养液，15d后进行BSFE活性检测。

本发明所述的方法，其中，测定枯草芽孢杆菌纤溶酶在转基因烟草根系及组织中的分泌表达是采用琼脂糖-纤维蛋白平板法，具体做法为：

1、BSFE活性标准曲线的制作

根据琼脂糖-纤维蛋白平板法标定BSFE标准酶活性。BSFE的标准曲线为：Y＝1.9832×-1.5683(R²＝0.9807)[X为直径(mm)平方的对数，Y为活性单位的对数]。