[发明专利]以金磁微粒为载体检测抗双链DNA抗体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测被测样品中的抗双链DNA抗体的方法，尤其涉及一种采用酶联免疫吸附法检测被测样品中的抗双链DNA抗体的方法。

背景技术

系统性红斑狼疮(SLE)是临床上较为常见的一种自身免疫性疾病，患者突出表现是存在多种自身抗体，其中最重要的是抗双链DNA抗体。这是一种能够与天然DNA结合的自身抗体，几乎仅在SLE患者中可检测到该抗体。抗双链DNA抗体滴度的消长与SLE患者的病情变化相关，随着疾病活动的控制，抗双链DNA抗体的滴度可以下降或消失。

早期的间接血凝、补体结合试验和对流免疫电泳等方法因灵敏度和特异性差而被淘汰，现在应用较广泛的检测方法大致有如下几种：免疫荧光法(IFT)、免疫印迹法(Immunoblot assay)、放射免疫法(RIA)、斑点免疫金渗滤法(DIGFA)、胶体金层析法和酶联免疫吸附法(ELISA)。

免疫荧光法(IFA)是将已稀释血清与实验基质进行温育，令特异性抗体与实验基质中相应抗原结合，然后再与荧光标记的第二抗体温育，最后在荧光显微镜下观察相应部位的特异性荧光模式。IFA法只能作为临床诊断的参考，不能作为确诊的重要依据。另外这种方法还需要一台质量较好的荧光显微镜，对操作人员要较高，操作复杂耗时长且存在其他干扰物质，易出现假阳性。

免疫印迹法(Immunoblot assay)是将聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白及多肽与免疫反应的高特异性相结合的一项技术，但其制备方法繁琐、成本相对较高。

放射免疫法(RIA)是以同位素标记的双链DNA与检测样品中的抗双链DNA抗体结合，易产生放射性污染，且有其他干扰物质易产生假阳性；检测需要特殊的仪器设备，检测时间长；不能实现单项检测。

胶体金免疫层析法是将包被抗原、胶体金标记抗体固相化，与样本吸附材料等组合在一起制备为免疫层析诊断试纸条。该方法只能进行定性检测。

酶联免疫吸附法(ELISA)是将抗原抗体反应的高度特异性和酶的高效催化作用相结合发展建立的一种非放射性标记免疫分析方法。该法是将纯化的DNA抗原包被在固相载体上，与一定稀释度的待测血清反应，然后与HRP标记的二抗(抗人IgG，IgA，IgM或抗人IgG.A.M的混合物)反应，HRP可于显色液发生显色反应，在酶标仪上采用双波段(450nm、630nm)测定其吸光度。由于ELISA具有灵敏度高、特异性强、酶免疫试剂的性质比较稳定，操作方法简便快速、无放射性污染以及应用范围广等很多优点，是目前应用最为广泛的一项免疫学实验。由于纯化的或重组的抗原生产技术的成熟，商品化用于抗双链DNA抗体检测的高质量ELISA试剂盒已日渐增多。由于该检测方法的灵敏度高、特异性强、可量化且排除了人为的主观判断，费用低廉，是目前国外大多数自身免疫诊断检测实验室的首选检测方法。但是国外一些公司生产的试剂盒价格昂贵，无法推广和大量使用。目前国内还没有自行生产的应用间接ELISA法检测抗双链DNA抗体的试剂盒面市。

目前，现有的检测抗双链DNA抗体的方法存在以下不足：

1、检测步骤繁琐，检测时间长，如RIA法及IFA法。

2、检测试剂需要冷藏，如RIA法、IFA法、免疫印迹法和斑点免疫金渗滤法。

3、检测需要特殊的仪器设备，如IFA法需荧光电镜检测，RIA法需γ-计数仪或γ-闪烁计数仪检测。

4、检测时存在放射性污染，如RIA法。

5、只能进行定性而不能进行定量检测，如胶体金免疫层析法，RIA法、IFA法和斑点免疫金滤法。

6、检测方法本身存在很强的主观性，如IFA法、胶体金免疫层析法均需人工读图，存在很强的主观判断因素。

7、目前国内大多数实验室对抗双链DNA抗体的传统ELISA检测方法还处于定性阶段。虽然抗双链DNA抗体的传统ELISA检测方法快速简便，较为准确，但是作为临床诊断还存在不足的方面，如检出的灵敏度差。因为传统ELISA法的载体为聚苯乙烯板，反应只在微孔表面进行，从而限制了该方法的检测灵敏度。故目前国内主要采用胶体金标记和快速膜斑点渗滤法定性的检测抗双链DNA抗体。

组装型磁性复合微粒和核/壳型超顺磁性复合微粒的制备方法以及结构组成已经在中国专利ZL 03153486.4和ZL 03124061.5分别进行了公开，但其应用中主要包括分子固定以及相关检测的内容，未涉及到抗双链DNA抗体检测方面的内容。

发明内容

本发明目的是提供一种检测抗双链DNA抗体的方法，其解决了现有检测抗双链DNA抗体的灵敏度差的缺点。