[发明专利]一种模拟人角膜真菌感染的动物模型的制作方法

说明书

技术领域

本发明属于医学模型，尤其涉及一种模拟人角膜真菌感染的动物模型的制作方法。

背景技术

真菌性角膜炎是一种致盲率很高的感染性角膜溃疡，随着抗生素和糖皮质激素的广泛应用以及对本病的认识和诊断水平的提高，其发病率不断增高。常见致病真菌有镰刀菌属、曲霉菌属、青霉菌属、念珠菌属，在我国农民患者居多，常发生于植物性角膜外伤后。目前对角膜真菌感染基础研究极少，其发病机制不清，缺乏模拟人角膜真菌感染的动物模型严重阻碍了真菌性角膜炎的基础研究。目前公开的有以下几种真菌性角膜炎动物模型制作方法：

1.角膜基质注射法：将标准菌株接种于沙堡氏培养基或马铃薯葡萄糖培养基培养72小时，实验时配制成新鲜的真菌混悬液，将混悬液作角膜板层间注射，为了提高真菌的感染率和维持角膜的持续感染，部分研究在接种真菌的前一天，将实验动物球结膜下注射一定量的类固醇激素，但获得的是深层角膜炎模型，多用于抗真菌药的研究。动物模型已严重破坏了角膜的板层结构，表现为从基质开始溃烂，不符合真菌性角膜炎的自然发病过程，不具备早或中期真菌性角膜炎的病理特点。

2.角膜划痕法：2003年Wu等应用NIH Swiss小鼠和BALB/C小鼠，分别在接种前5天、1天肌肉注射甲基强的松龙100mg/kg，或在接种前5天、3天、1天注射环磷酰胺180mg/kg，然后用皮下针头在角膜表面格子样划痕，表面涂0.005ml白色念珠菌混悬液，闭合眼睑数秒使真菌均匀分布。实验中没有应用免疫抑制剂的小鼠接种后角膜内真菌量迅速下降。2004年他们又用相同方法接种腐皮镰刀菌，发现病理切片中，没有应用免疫抑制剂的BALB/C小鼠接种后第四天角膜基质中即不能检查到或偶尔有很少量真菌菌丝，所以这种方法是以预先使动物处于免疫低下状态为基础的，而临床上大部分真菌性角膜炎患者发病时并非处于免疫抑制状态，不符合临床自然发病过程，而且划痕深浅不易掌握，易致角膜穿孔，不适用于感染的发生、发展及其机制的研究。

3.角膜接触镜法：1999年O’Day等提出新方法，将实验兔分为四组，三组分别在接种真菌前一天结膜下注射曲安奈德，分别给予1mg、3mg、12mg的剂量，另外一组不注射，完整刮除兔角膜中央直径7mm范围的上皮，然后覆盖上软性角膜接触镜，在接触镜与角膜层间注入0.1ml菌液浓度为1010CFU/ml的白色念珠菌，再行暂时性睑裂缝合术，24小时后打开睑裂并去除角膜接触镜，发现没有应用曲安奈德的动物菌丝侵入限制在基质前部，且很稀少。应用曲安奈德的感染真菌量大，菌丝密度高，且随着皮质类固醇量的增加而感染加重。此方法感染成功率较高，可不依赖皮质类固醇激素，但制作过程较复杂，而且与人感染真菌性角膜炎过程不同，所需角膜接触镜造价高，不适合广泛推广应用。

4.角膜表面镜片术法：有实验室应用角膜镜片术建立浅层真菌性角膜炎模型：制备带有2mm巩膜环的兔角膜植片，麻醉兔后切除角膜上皮，将角膜植片放射状缝合于受体角膜的周边部。将1ml念珠菌液注入植片与植床角膜层间中央。也有报道用标准菌株感染离体角膜，然后将感染的角膜植片缝合于刮除上皮的兔角膜表面，暂时缝合眼睑，24-48小时后拆除感染角膜。这两种方法感染成功率高，都避免了激素对实验结果的影响，但不符合临床自然感染病程，方法操作过程相对复杂，对实验者的手术技术水平有一定的要求。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简单易行，材料容易得到，对研究者无特殊技术要求、模型制作成功率高的模拟人角膜真菌感染的动物模型的制作方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种模拟人角膜真菌感染的动物模型的制作方法，由真菌菌种准备、接种物准备、动物准备、动物接种和接种后处理步骤组成，在接种物准备步骤中，选用真菌容易附生的植物性接种载体，修剪成合适尺寸，经高压消毒灭菌后放入真菌培养管中，使真菌在其表面生长，15-35℃下培养3-6天；

在动物准备步骤中，选用无眼部疾患的鼠科动物，接种前三天用抗菌药滴眼；

在动物接种步骤中，将动物麻醉后，严格无菌条件下用带有所需真菌的接种物在动物角膜表面划痕，深度达浅基质层，划痕后行睑裂缝合术；

在接种后处理步骤中，接种24小时后打开眼睑，每天使用抗菌药滴眼。

在接种后处理步骤中，加用免疫抑制剂滴眼，每天2-5次。

所述的免疫抑制剂为肾上腺皮质激素或环孢素。

所述的肾上腺皮质激素为泼尼松龙、泼尼松或地塞米松。

所述的鼠科动物为远交系或近交系小鼠或大鼠。