[发明专利]纳豆激酶的制造方法

权利要求书

1.一种纳豆激酶的制造方法，其包括：

发酵，将纳豆激酶从纳豆菌中释放出来，使发酵液中含有纳豆激酶及纳豆菌细胞；

将发酵液中纳豆菌细胞的细胞壁破碎，释放出发酵过程中，卡在细胞壁的纳豆激酶；以及

将细胞壁破碎后的发酵液离心并收集上清液以制得纳豆激酶溶液。

2.权利要求1所述的纳豆激酶的制造方法，其进一步包括：纯化所述的上清液，以获得纯化后的纳豆激酶溶液。

3.权利要求1所述的纳豆激酶的制造方法，其中，所述细胞壁破碎的步骤包括：于1秒内改变发酵液所处环境的压力，以使纳豆菌细胞壁破碎。

4.权利要求3所述的纳豆激酶的制造方法，其中，所述细胞壁破碎的步骤中，改变发酵液所处环境的压力为将发酵液所处环境的压力于约1秒内提升至约2000磅/平方英寸(Psi)再瞬间降至常压。

5.权利要求3所述的纳豆激酶的制造方法，其中，所述细胞壁破碎的步骤包括多个重复的约1秒内改变发酵液所处环境的压力的步骤。

6.权利要求1所述的纳豆激酶的制造方法，其中，所述细胞壁破碎的步骤包括：将发酵液反复冷冻，将温度降至约-1℃以下，形成水冰晶，以刺破纳豆菌细胞壁。

7.权利要求1所述的纳豆激酶的制造方法，其中，所述细胞壁破碎的步骤包括：于发酵液中加入分解酶，以溶解纳豆菌细胞壁。

8.权利要求7所述的纳豆激酶的制造方法，其中，所述分解酶为溶酶体(Lysosome)或酰胺酶(Amidase)或葡糖苷酶(Glucosidase)。

9.权利要求1所述的纳豆激酶的制造方法，其中，所述的发酵步骤包括：从固体培养基挑取表达纳豆激酶的单菌落接入约10～200毫升的种子培养基中，约150～300转/分钟(rpm)下摇床培养约8～25小时，按约1％～5％接种量接入发酵培养基中，再于约28～37℃、150～300转/分钟(rpm)下发酵罐培养约100～150小时。

10.权利要求1所述的纳豆激酶的制造方法，其中，所述的离心步骤包括：用冷冻离心机将发酵液于约0～20℃下以约2000～10000转/分钟(rpm)的速度离心约8～15分钟，收集上清液，于上清液中加入约10～40％饱和度的硫酸铵(NH₄)₂SO₄沉淀，约2000～10000转/分钟(rpm)离心收集上清液，继续在上清液中加入硫酸铵至约60～85％的饱和度，约2000～10000转/分钟(rpm)离心收集沉淀，将沉淀重悬于约10～100毫摩尔浓度(mM)、pH值约为6～8的磷酸缓冲液中，约2000～10000转/分钟(rpm)离心约10～30分钟收集上清液，于约0～20℃保存备用。

11.权利要求2所述的纳豆激酶的制造方法，其中，所述的纯化步骤包括：用层析系统将上清液以约10～100公分/小时(cm/h)的线速度加入凝胶层析柱中，用约10～200毫摩尔浓度(mM)的磷酸缓冲液以相同的线速度洗涤至出峰完毕，用紫外检测仪于波长为约280纳米(nm)和约260纳米(nm)进行检测，收集保留体积为约9～15毫升(ml)处的洗脱液，收集液体积为约3～6毫升(ml)，此步骤可称作凝胶层析分离。

12.权利要求1所述的纳豆激酶的制造方法，其中，该纳豆激酶的制造方法进一步包括如下步骤：将纳豆激酶溶液放在去离子水(离子水)中透析脱盐然后干燥而制得纳豆激酶产品。

13.权利要求11所述的纳豆激酶的制造方法，其步骤进一步包括：将精制步骤中收集得到的洗脱液放置于去离子水中进行透析脱盐约16～32小时后，置于-20℃冰箱下冷冻约12～24小时将其进行冷冻干燥，干燥时间为约24～48小时，即得到高纯度的纳豆激酶产品。