[发明专利]羊型布鲁氏杆菌M5菌株核糖体蛋白L7/L12的基因、其编码蛋白及应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及羊型布鲁氏杆菌M5菌株(Brucella melitensis M5)核糖体蛋白L7/L12的基因、其编码蛋白及应用。

背景技术

布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌属引起的一种人畜共患传染病。布鲁氏菌是哺乳动物寄生菌，对人和哺乳动物具有高度感染性和致病性。该菌属有羊、牛、猪、犬、林鼠、海洋哺乳动物和绵羊七个生物种，中国流行的主要是前4种。羊、牛、猪等家畜最易感染，其中以羊种最为常见。由于布鲁氏菌是兼性细胞内寄生菌，它不仅寄生于单核-巨噬细胞系统，且可在胎盘绒毛上皮细胞、肾实质细胞、睾丸的纤维母细胞及胚胎细胞中繁殖，引起生殖器官和胎膜发炎、流产、不育和各种组织的局部病灶。人类对布鲁氏菌易感，一般羊种布鲁氏菌对人毒力最高。人与病畜接触后，细菌可通过消化道和呼吸道粘膜、皮肤及眼结膜等途径而感染。

由于布鲁氏菌的细胞内寄生特性，致使抗生素等化学药剂对其防治效果较差，而只有机体产生的由T细胞介导的细胞免疫则是预防及控制该病的最为有效的措施。虽然目前应用的全菌减毒活疫苗、死疫苗及亚单位疫苗对于疾病的发生起到了一定的预防作用。但是由于不能诱导机体产生强而有效的细胞介导免疫，因而研究与开发新型疫苗对于控制疫情的蔓延已经成为一项重要的研究课题。由于布鲁氏菌的细胞内寄生特性，使其可以在巨噬细胞内长期潜伏，因此，接种疫苗的关键在于能够诱导机体产生具有记忆功能的适应性免疫应答，细胞介导免疫是针对布鲁氏菌病所需要的最重要的免疫应答。因此，选择能够诱导Th1型免疫应答的T细胞抗原研制亚单位疫苗或者选择编码T细胞抗原的基因制备DNA疫苗国内外已有一些报道。最近一些国家应用的牛种RB51、羊种REV.1及羊种M5(司瑞等，羊布鲁氏菌BCSP31、OMP31、L7/L12基因的原核表达载体构建及表达，中国人兽共患病杂志，1002-2694(2005)11-0961-04)(中国)减毒活疫苗，虽然可以分别用于牛和羊的免疫，然而，这些遗传性不确定的菌株仍可引起流产和持续性发热，致使其安全性和有效性出现了问题。

目前已经证实的布鲁氏杆菌T细胞抗原包括BFR、P39、L7/L12、SOD及31KD蛋白等已经用于亚单位疫苗的实验研究，而这些蛋白抗原的编码基因也有用于DNA疫苗的实验研究。但目前国内外尚未见有关羊型布鲁氏杆菌M5菌株核糖体蛋白L7/L12的基因序列和氨基酸序列的报道。由于现有疫苗存在诸多不足，同时人群对羊型布鲁氏杆菌最易感、毒性反应最强烈，因此造成了近年来布鲁氏菌病感染率呈直线上升趋势，对畜牧业的发展及人类的健康造成极大的危害。筛选和鉴定羊型布鲁氏杆菌M5菌株L7/L12基因对开发新型疫苗及检测试剂盒具有极其重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供羊型布鲁氏杆菌M5菌株核糖体蛋白L7/L12的基因、其编码蛋白及应用。

L7/L12基因具有如序列表SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，其编码蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。本发明还包括序列表SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的衍生蛋白质，以及编码这些蛋白质的基因。

L7/L12基因全长438bp，5’非编码区长39bp，3’非编码区长24bp，自40bp～414bp为其开放阅读框，编码124个氨基酸。在GenBank中进行同源搜索，未发现与该基因相同的序列报道，为一新基因。

本发明基因可以通过如下方法获得：以羊型布鲁氏杆菌M5菌株基因组DNA为模板，利用如序列表SEQ ID NO.3和4所示的引物进行扩增，扩增条件是：94℃预变性4min后，以94℃30s、55℃40s、72℃40s反应35个循环，72℃延伸10min。

本发明还包括含有上述基因的表达载体、含有所述表达载体的宿主细胞。

利用本发明的基因可以用来制备基因疫苗，如通过本发明的序列设计合成siRNA或者shRNA或者是microRNA用于基因沉默。也可以通过制备本发明基因的表达蛋白，研发重组蛋白疫苗，或者是开发检测试剂盒。

本发明的基因具有极其重要的价值，通过本发明基因开发出的相关基因工程产品，可以有效地用于布鲁氏菌病的检测、预防和治疗。为布鲁氏菌病提供有新的有效的解决途径。

附图说明

图1为PCR获得的目的基因片段L7/L12的琼脂糖凝胶电泳检测结果，图中1为DL2000 DNA Marker；2、3为PCR产物。