[发明专利]利用固定化细胞进行汽爆秸秆酶解耦合发酵制氢的方法

说明书

技术领域

本发明属于发酵工艺技术领域，主要涉及利用固定化细胞进行汽爆秸秆酶解耦合发酵制氢的方法

背景技术

氢气是一种清洁、高效的能源，是化石燃料良好的替代品。常规的制氢方法，如电解水法和化石原料热裂解法(Adnan M.Int J Hydrogen Energy，2001：26：29-27；Ayhan D.Energy Sources，2002：24：59-68.)，存在着能耗高，产物成分复杂，分离成本高等缺点，不能从根本上解决能源和环境问题。以可再生的生物质资源为原料，依靠微生物发酵的生物制氢日益成为研究的方向和热点。

秸秆是一类来源非常丰富，价格极为低廉的可再生性资源，经汽爆处理后，秸秆中的部分半纤维素发生降解，纤维素的致密结构被破坏，易于降解而成能够被微生物所利用的小分子糖类。在以汽爆秸秆为底物的微生物发酵过程中，添加纤维素酶使底物中的纤维素和半纤维素降解以产生微生物能够利用的小分子可溶性糖，是提高汽爆秸秆原料利用率的关键。

丁酸梭菌(Clostridium butyricum)能够利用包括葡萄糖、木糖、纤维二糖等多种糖类在内的大部分木质纤维素水解物，是以秸秆为原料进行发酵产氢的理想菌种(Hawkes FR.Int J Hydrogen Energy 2002，27：1339-1347.)。常用的利用汽爆秸秆发酵制氢的方式是同步糖化发酵，即将纤维素酶和菌种同时加入以汽爆秸秆为主要原料配制的培养基中，边酶解边发酵(陈洪章，李佐虎。使用汽爆植物秸秆发酵制备氢气的方法。国家发明专利，CN1500879A)。但是，由于纤维素酶解的最适温度为50℃，而以C.butyricum为产氢菌时，发酵罐的温度须保持在C.butyricum的最适生长温度35℃，两者之间的最适温差有15℃，导致纤维素酶的活性难以正常发挥，发酵效率难以提高。因此，有必要探索新的发酵方式以解决这一矛盾。

发明内容

本发明的目的是针对以汽爆秸秆为原料进行同步糖化发酵制氢的过程中，纤维素酶解的最适温度和微生物发酵的最适温度不一致的问题，提供一种使酶解和发酵分别在不同的反应器中，在各自最适的温度下同时进行的新方法。

本发明利用海藻酸钠为固定化材料制取固定化细胞，汽爆秸秆原料置于酶解罐中，温度保持在50℃；固定化细胞置于发酵罐中，温度保持在35℃。利用循环泵将发酵液在两个罐之间循环，酶解产生的糖不断被洗脱下来，随着循环液体进入发酵罐中，补充被微生物消耗的糖。在同步糖化发酵中，纤维素酶和微生物都保持在较高的活性状态，从而提高氢气产率和底物转化率。

本发明的技术方案如下：

本发明提供的利用固定化细胞进行汽爆秸秆酶解耦合发酵制取氢气的方法，其步骤如下：

(1)制备丁酸梭菌固定化细胞

将处于对数生长期的丁酸梭菌(C.butylicum AS1.209)种子液与质量百分比浓度为2～5％海藻酸钠溶液混合，得丁酸梭菌种子液海藻酸钠混合液；所述丁酸梭菌种子液与海藻酸钠溶液混合的体积比为1∶3～6；

用无菌注射器吸取丁酸梭菌种子液海藻酸钠混合液，推动注射器，将混合液滴入浓度为0.05mol/l的无菌CaCl₂溶液中，保持30分钟，制取丁酸梭菌固定化细胞；所述混合液与无菌CaCl₂溶液的体积比为1∶3～6；

(2)在制取固定化细胞的同时，将汽爆秸秆料置于在酶解罐中，在50℃下静置制备酶解液；

所述酶解液的制备如下：将汽爆秸秆料置于酶解罐中，加入纤维素酶和用硫酸调节pH4.8的水溶液，50℃下酶解得酶解液；每克汽爆秸秆料加25IU纤维素酶；每升所述水溶液含尿素或酵母抽提物2g，KH₂PO₄ 0.51g和MgSO₄ 0.31g；所述汽爆秸秆重量与水溶液体积的固液比是1∶8～12(w/v)；

(3)酶解耦合发酵制取氢气

固定化细胞制取好以后，开启安装在酶解罐与发酵罐之间的连接管路上的循环泵把一部分酶解液泵入发酵罐，待固定化细胞被浸没后，关闭循环泵停止循环，迅速向发酵罐通入氮气除氧，于35℃下进行固定化细胞预培养；

待细胞预培养6～12小时后，再次开启循环泵源源不断地将酶解液泵入发酵罐中，同时发酵罐中的发酵液不断被循环泵回酶解罐中，进行酶解耦合发酵制得氢气；发酵罐中发酵产生的氢气从发酵罐顶端排出，用排水集气法收集所制得的氢气。

所述的固定化细胞预培养是利用酶解产生的糖液进行的。