[发明专利]重组人肿瘤坏死因子－α的生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域。更具体地，本发明提供了一种高效生产重组人重组人肿瘤坏死因子-α的方法，以及有关的重组人肿瘤坏死因子-α的核苷酸序列、工程细胞的构建、重组人肿瘤坏死因子-α的表达和纯化工艺。

背景技术

肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor alpha，TNF-α)是一类具有广泛生物学作用的细胞因子。它是由157个氨基酸残基组成，SDS-PAGE分子量为17，000道尔顿的蛋白质。天然TNF-α主要由激活巨噬细胞和一些细胞系如HL-60、U937等细胞所分泌。八十年代后许多实验室已成功地克隆了TNF-α的基因，促进了TNF-α分子结构和功能的深入研究，并为TNF-α应用于临床治疗的研究提供了充足的来源。

TNF-α的主要生物学功能有：

1.抑瘤作用。大量实验研究和临床I和II期应用的资料初步证实了TNF-α对某些肿瘤细胞具有细胞毒和抑制生长的作用。但并不是对全部肿瘤细胞都具有抑制效应。例如人上皮癌细胞中三分之一是对TNF-α有明显细胞毒反应，另外三分之一则表现为生长受抑制，其余三分之一对TNF-α不敏感。在人白血病细胞中对TNF-α反应最敏感的是T淋巴系白血病细胞，其次为髓系和粒系白血病细胞，对TNF-α敏感性最差的则是B淋巴系白血病细胞。一些卵巢癌、乳腺癌、骨髓瘤、肺癌、肝癌和成纤维细胞瘤等各类肿瘤细胞中对TNF-α的敏感度也有所差异。由此而知，TNF-α对肿瘤的抑瘤作用不是光谱的，而是有选择性的。

2.TNF-α具有抑制病毒或对病毒感染的细胞具有杀伤作用。TNF-α可产生剂量依赖性的抑制病毒复制作用，它可抑制DNA类病毒如：腺病毒-2型(Ad-2)，单纯疱疹型病毒II型(HSV-2)等，还抑制RNA病毒如：脑心肌炎病(EMCV)，疱疹性口炎病毒(VSV)等。TNF-α还可以对病毒感染的细胞选择性杀伤，这可能是因为受病毒感染后的细胞对TNF-α敏感性增强。如TNF-α对EB病毒感染后的B细胞具有明显的细胞毒作用。TNF-α还具有抑制牛百姓白血病病毒(BLV)的作用。

3.TNF-α对多核中性粒细胞有激活作用。TNF-α可以促进多核中性粒细胞的吞噬功能，同时使多核中性粒细胞介导的抗体依赖补体细胞毒(ADCC)作用明显增强，致使对肿瘤细胞或者病毒感染细胞的杀伤效应增强。

4.TNF-α参与机体免疫调节。由于TNF-α本身是一类具有广泛生物学效应的细胞因子，它的产生和释放及水平的变化直接或间接地影响着其它细胞因子和效应因子的状态和功能。对肿瘤细胞产生细胞毒或抑制作用的TNF-α剂量足以导致GM-CSF、IL-1、IL-2和各类激素及小分子炎症物质的分泌，从而引起一系列复杂的连锁生物学效应。TNF-α在免疫系统中具有增强抗原诱导T细胞增殖的作用，刺激T细胞克隆的生长，增强HLA-DR抗原的表达，同时也可以是激活T细胞表面IL-2受体表达水平增加。有人还认为TNF-α与器官移植中的移植物抗宿主病(GVHD)有着密切的关系，用抗TNF-α的抗体预防器官移植中的GVHD的发生将有益的。

在TNF-α的众多生物学功能中，它的抑瘤作用倍受人们的关注。1984年，TNF的cDNA克隆成功，其基因工程产品已试用于临床。但一个突出的问题是TNF-α在体内的半衰期短，低剂量注射抗瘤效果不显著。要达到疗效水平，需持续大剂量注射，又远远超过了人的耐受剂量，这往往会引起发热、寒战、疲劳、头痛、休克等全身症状，临床应用效果不理想，因而限制了临床上的广泛应用。为提高TNF-α的抗肿瘤活性，消除或降低其毒副作用，尽快将TNF-α应用于临床，国内外科学家进行了不懈的努力。目前制备新型TNF-α的研究，一方面是在对hTNF2α结构与功能关系的研究基础上，对TNF-α分子进行结构改造，获得TNF-α的衍生物；另一方面是将TNF-α同另一个能与靶细胞专一性结合的蛋白质或肽融合，构建融合蛋白，以增加其在靶细胞部位的浓度，从而起到增加疗效、减少毒副作用的效果。

具有生物活性的TNF-α其空间结构是3个TNF-α单体以边对面形式形成的近似三角锥形的三聚体，结构与功能研究表明，删去N端前7个氨基酸残基不影响TNF-α三聚体空间结构。在删去N端7个氨基酸残基的同时增加N端的碱性氨基酸，可以增强形成活性三聚体的能力，从而提高TNF-α的抗肿瘤活性。另外，研究表明增加C端的疏水性氨基酸可以提高TNF-α的抗瘤活性。基于TNF-α结构与功能的关系，国内外研究者对TNF-α的N端、C端的结构基因进行了各种定点突变，并获得了许多新型有效的TNF-α衍生物。