[发明专利]重组人粒细胞集落刺激因子的生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域。更具体地，本发明提供了一种高效生产重组人粒细胞集落刺激因子的生产方法，包括有关的重组人粒细胞集落刺激因子编码序列、工程菌的构建、重组人粒细胞集落刺激因子的表达和纯化工艺。

背景技术

粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是血管内皮细胞、单核细胞和成纤维细胞合成的糖蛋白。G-CSF能促进中性粒细胞(ANC)成熟；刺激成熟的粒细胞从骨髓释出；增强中性粒细胞趋化及吞噬功能，对巨噬细胞、巨核细胞影响很小。G-CSF主要作用于中性粒细胞系(lineage)造血细胞的增殖、分化和活化。在体外G-CSF刺激骨髓造血祖细胞中中性粒细胞集落的形成，延长成熟中性粒细胞的存活时间，活化中性粒细胞，促进其ADCC，超氧阴离子的产生和碱性磷酸酶的合成。

最近研究表明，单独G-CSF或与干细胞因子(SCF)协同可促进多能造血干细胞的增殖、干细胞母细胞集落形成以及体内粒细胞集落形成单位(CFU-G)的形成。G-CSF还具有对人粒细胞、单核细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞以及成肌纤维细胞的趋化作用。

人类的G-CSF基因定位于17q21-22。rhG-CSF有4种不同的形式：filg rastim(Neupogen)，nartograstim(Ro25-8315)，lenograstim(Granuocyte)，SD/O1(filgrastimsustained duration)。前两者在美国应用于临床，后两者在欧洲应用。lenograstim是惟一糖基化的rhG-CSF。体外实验中，当pH及温度改变时，糖基化可增强GCSF的稳定性及抗血清酶的分解作用P1。实际上，lenograstim与受体的亲和力是filgrastim的3倍：前者在刺激中性粒细胞克隆成熟方面所需的浓度为后者的1/16。

重组人粒细胞集落刺激因子rhG-CSF，可作为针对肿瘤病人放、化疗后白细胞减少，治疗用的现代基因工程蛋白质药物。特别是在新生儿败血症、HIV感染及AIDS感染，自身免疫性粒细胞减少以及肿瘤放化疗中的应用有着积极的作用。因此，开发新的高效生产重组人粒细胞集落刺激因子的方法很有必要。

人类G-CSF成熟蛋白由174氨基酸组成，理论分子量为18.7kD。本发明根据人G-CSF的氨基酸序列，按照大肠杆菌密码子偏爱性原则，人工合成重组人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)基因的全序列，将它克隆入质粒pET-30(+)，然后转化入大肠杆菌BL21(DE3)，经表达筛选获得G-CSF高表达工程菌。表达产物经Western-blotting、质谱分析及氨基酸N端测序等方法进行了结构确证，为重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)的大规模制备奠定了基础。

发明内容

本发明的目的就是提供一种高效和/或简便的生产重组人粒细胞集落刺激因子的方法。

本发明的另一目的就是提供优化的重组人粒细胞集落刺激因子的编码序列和用于该方法的表达载体及工程菌株。

在本发明的第一方面，就是提供了一种优化的编码重组人粒细胞集落刺激因子的核苷酸序列。参见图1。

在本发明的第二方面，提供了一种表达载体，含有权利要求1所述的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的表达载体是pET30a(+)/rhG-CSF。

在本发明的第三方面，提供了一种工程细胞，其特征在于，含有权利要求2所述的表达载体。

在另一优选例中，所述的工程细胞是大肠杆菌BL21(DE3)，是多个蛋白酶的基因缺陷菌株，基因型为hsdSgal(λcIts857ind1Sam7nim5lacUV5-T基因)，非常适合外源基因的高效表达。

在本发明的第四方面，提供了一种生产重组人粒细胞集落刺激因子的方法，该方法包括步骤：

a)在适合的表达条件下，培养如权利要求4所述的宿主细胞，从而表达出重组人粒细胞集落刺激因子；较佳地，所述的宿主细胞是大肠杆菌细胞BL21(DE3)。

b)分离纯化出表达的重组人粒细胞集落刺激因子。

在本发明的另一优选例中，rhG-CSF在大肠杆菌中以包涵体形式存在，挑选一株确证好的表达工程菌，用LB培养基进行培养及用1mM IPTG诱导表达，收集菌体，经过压榨破菌、包涵体变性、复性、阳离子交换层析等纯化步骤，终产物纯度达90％以上。

附图说明

图1.rhG-CSF理论序列与rhG-CSF优化序列的同源性比较。Query：原来的rhG-CSF基因序列；Sbjct：优化的rhG-CSF基因序列。